結(jié)核病( tuberculosis，TB) 是由結(jié)核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的傳染 病。結(jié)核分枝桿菌（MTB）俗稱結(jié)核桿菌（tubercle bacillus），菌細(xì)長略彎曲，有時(shí)可見分枝，呈單、成堆或成束排列，無鞭毛、無芽胞，有莢膜。可出現(xiàn)多形性，在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長絲形等。MTB革蘭染色陽性，不產(chǎn)生內(nèi)外毒素。

Genome of M. tuberculosis

結(jié)核分枝桿菌基因組大小為4.4 Mb，基因組G/C含量高達(dá)65.6%，預(yù)測含4411個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中3924個(gè)ORF被認(rèn)為編碼蛋白質(zhì)，50個(gè)基因編碼穩(wěn)定的RNA。如由MTB Rv3875基因編碼的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并提供一定的抗結(jié)核免疫保護(hù)；Rv3804c基因編碼的Ag85A蛋白是MTB的主要分泌蛋白Ag85復(fù)合物成分之一，可使細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活力升高；Rv2660c基因編碼的蛋白在MTB處于休眠狀態(tài)時(shí)仍能持續(xù)表達(dá)，提示Rv2660c基因可作為清除潛伏性感染階段MTB的作用靶點(diǎn)；Rv3428c位于MTB的RD11 區(qū)，編碼插入序列IS1532 的轉(zhuǎn)座酶，可引起體內(nèi)的細(xì)胞與體液免疫，Rv3428c編碼的重組蛋白具有增加γ－干擾素在小鼠中的表達(dá)潛力，可作開發(fā)結(jié)核疫苗的融合抗原。有研究表明Rv3428c重組蛋白有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，Rv3428c的重組蛋白輔助診斷陰性菌的肺結(jié)核有81. 5%靈敏度和82. 0%特異度。

為進(jìn)一步探討Rv3428c在MTB特異性診斷中的研究價(jià)值，來自四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院的研究人員通過同源重組得到pET28a-Rv3428c表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入E. coli BL21( DE3)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。重組蛋白免疫小鼠后進(jìn)行細(xì)胞融合，間接ELISA、Western Blot篩選陽性雜交瘤細(xì)胞系，以篩選獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，蛋白A親和層析法純化抗體，BCA法測定濃度，ELISA和SDS-PAGE進(jìn)行單克隆抗體的鑒定及亞型和效價(jià)的測定。

Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector

普健生物擁有十余年的重組蛋白表達(dá)和雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體制備經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過不斷的探索和改進(jìn)，開發(fā)了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，擁有獨(dú)特的表達(dá)純化及復(fù)性平臺(tái)，95%以上的超高蛋白表達(dá)成功率，已成功交付上萬例大腸桿菌表達(dá)服務(wù)項(xiàng)目。如果您有大腸桿菌重組蛋白表達(dá)與純化項(xiàng)目需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專員進(jìn)行溝通！此外，普健生物長期為國內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)，IVD企業(yè)，抗體藥物企業(yè)提供抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)服務(wù)，積累豐富的抗體開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，可以提供DNA免疫，多肽、蛋白免疫，小分子免疫；高通量定制化抗體篩選方案；ELISA、WB、IF、IHC、FC、Biacore 等多樣性高通量檢測平臺(tái)以及雜交瘤測序技術(shù)和重組抗體表達(dá)服務(wù)。如果您有雜交瘤抗體制備需求或相關(guān)技術(shù)咨詢，歡迎聯(lián)系027-87001869共同交流探討！

最終測序結(jié)果表明，插入序列與MTB H37Rv基因組Rv3428c公布的序列一致，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)與純化，純化的重組蛋白使用超濾管進(jìn)行超濾濃縮，SDS－PAGE分析目的蛋白的表達(dá)。

Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein

隨后，通過Western blot篩選出一株效果好的陽性雜交瘤細(xì)胞株，通過體內(nèi)誘生法制備獲得Rv3428c單克隆抗體。該單抗屬于IgG2a亞類，κ型輕鏈，效價(jià)約為1∶128000，濃度為4 mg /ml。

Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody

Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA

Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA

Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes

關(guān)于MTB診斷抗原的研究有很多，但應(yīng)用于檢測抗原的研究相對(duì)比較空白。Rv3428c特異性地在結(jié)核分枝桿菌中表達(dá)，其他分枝桿菌中不存在該基因，因此特異性好。這項(xiàng)研究成功構(gòu)建了MTB的RD11區(qū)Rv3428c 表達(dá)載體，大量表達(dá)并純化蛋白，成功制備Rv3428c單克隆抗體。為后續(xù)探索其在臨床樣本中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床MTB快速抗原檢測試劑盒提供參考，為尋找早期、方便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法奠定基礎(chǔ)。

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