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基于納米抗體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)探討納米抗體的穩(wěn)定性研究

發(fā)表時間:2024-07-02 訪問次數(shù):845

駝類動物體內(nèi)含有3種不同亞型的抗體,分別是常規(guī)抗體IgG1、天然缺失輕鏈及CH1恒定域的重鏈抗體(heavy-chain antibody,HCAb)IgG2和IgG3。這種保留了全部抗原結(jié)合能力的天然無輕鏈及CH1區(qū)的單域抗體因其質(zhì)量?。s15 kDa,為IgG的十分之一),也被稱為納米抗體(nanobodies,Nbs)或VHH抗體(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody)。與傳統(tǒng)抗體片段如抗原結(jié)合片段(fragment of antigen binding,F(xiàn)ab)和單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)相比,納米抗體(nanobodies,Nbs)具有多個明顯的優(yōu)勢,比如免疫原性弱、生產(chǎn)成本低、水溶性好、組織滲透性好、穩(wěn)定性與親和力較高等。正是這些優(yōu)良特性使得納米抗體(nanobodies,Nbs)在生物技術(shù)方面得到了非常廣泛的應(yīng)用。

Structures and molecular mass of three different subtypes of antibodies and antibody fragments in camelid animals

 

對于大多數(shù)應(yīng)用而言,穩(wěn)定性是制約抗體應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。一方面抗體在其生產(chǎn)、運輸、儲存及使用的過程中容易發(fā)生多種物理和化學(xué)降解,另一方面抗體的不穩(wěn)定性聚集會潛在地影響產(chǎn)量、保質(zhì)期和免疫原性等應(yīng)用參數(shù)。因此抗體的穩(wěn)定性不僅會影響其生物學(xué)和生化評估,還會影響純化、儲存以及配方設(shè)計和生產(chǎn)。在各種類型的抗體中,納米抗體(nanobodies,Nbs)顯示出極好的溶解性,并且對高溫和化學(xué)變性具有顯著的抗性,可以很大程度地克服傳統(tǒng)抗體片段scFv的聚集和降解等穩(wěn)定性問題,是許多應(yīng)用的理想選擇。

納米抗體(nanobodies,Nbs)與常規(guī)抗體可變區(qū)(variable region of heavy chain,VH)的空間結(jié)構(gòu)相似,其框架是由9個反向平行的β折疊片層(A-B-C-D-E-F-G-H-I)通過鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起組成。在此結(jié)構(gòu)中,3個CDR分別連接BC、DE和HI鏈,并靠N端形成連續(xù)表面,與抗原表位的表面互補。連接CDR之間的氨基酸序列相對比較保守,稱為骨架區(qū)(framework region,F(xiàn)R)。幾乎所有納米抗體(nanobodies,Nbs)結(jié)構(gòu)都含有一個連接FR1(C23)和FR3(C104)的保守二硫鍵,該鍵跨越蛋白質(zhì)的內(nèi)部,將兩個β鏈連接起來,增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。部分納米抗體(nanobodies,Nbs)還含有一個可限制CDR環(huán)柔韌性和構(gòu)象自由度的額外二硫鍵。

 

Structure of Nbs

 

 

傳統(tǒng)抗體VH和VL通過疏水作用力來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并共同構(gòu)成抗原結(jié)合區(qū)。與之相比,納米抗體(nanobodies,Nbs)僅含有3個可變區(qū),盡管與抗原結(jié)合界面的表面積減少,但其仍具有較高的穩(wěn)定性與親和力。

它主要通過以下兩種方式來適應(yīng)輕鏈的缺失:

一、大量的親水性氨基酸取代先前與CH1、VL結(jié)合界面的脂肪族殘基(L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L),且部分FR2被拉伸扭轉(zhuǎn)的CDR3環(huán)覆蓋,避免與外界水環(huán)境的接觸,從而防止納米抗體(nanobodies,Nbs)的二聚化,其CDR3環(huán)越長,納米抗體(nanobodies,Nbs)越穩(wěn)定。另外還可在CDR3末端形成疏水核心,有利于穩(wěn)定Nbs的折疊結(jié)構(gòu)域。

二、納米抗體(nanobodies,Nbs)的CDR1和CDR3普遍比VH的長,潛在地增加了互補位構(gòu)象的多樣性,從而以高度的形狀表面互補性與相應(yīng)的抗原結(jié)合,一定程度上彌補了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降以及因尺寸小而導(dǎo)致的潛在序列多樣性降低。

納米抗體(nanobodies,Nbs)的小分子和單域?qū)傩再x予了其比常規(guī)抗體更為穩(wěn)定的特性,然而并非所有的納米抗體(nanobodies,Nbs)都具有很好的熱穩(wěn)定性與化學(xué)穩(wěn)定性。在以往研究的多個納米抗體(nanobodies,Nbs)中,大約有2/3的納米抗體(nanobodies,Nbs)在65℃處理后發(fā)生了不可逆的聚集,但是部分納米抗體(nanobodies,Nbs)在90℃高溫處理后仍具有90%的活性。這些穩(wěn)定性差異的根本原因在于納米抗體(nanobodies,Nbs)特殊結(jié)構(gòu)的差異,包括氨基酸序列、二硫鍵的數(shù)量與位置、結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象等。

那么,如何構(gòu)建穩(wěn)定性更高、親和力更強的納米抗體(nanobodies,Nbs)呢?普健生物深耕蛋白抗體領(lǐng)域15余年,在高質(zhì)量納米抗體(nanobodies,Nbs)制備技術(shù)上擁有自主核心技術(shù),與知名科研單位、研究院所、醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)成功合作相關(guān)項目20000+。在納米抗體的制備方面,動物的選擇是免疫成功的關(guān)鍵,普健生物自建養(yǎng)殖基地,每年近百頭成年羊駝用于免疫,穩(wěn)定提供大量的免疫抗原。通過設(shè)計目標(biāo)抗原對健康強壯、精神良好、體型適中的羊駝進(jìn)行四輪免疫后進(jìn)行效價檢測,當(dāng)血清免疫效價達(dá)到預(yù)期后,再提取總RNA用于噬菌體文庫的構(gòu)建,利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選得到高特異性和強親和力的納米抗體。

 

 

 

此外,普健生物還可根據(jù)科研需求,在分子設(shè)計時選擇性加入功能區(qū)或基于納米抗體(nanobodies,Nbs)結(jié)構(gòu)特征采用合理的設(shè)計方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化,例如共有序列驅(qū)動的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、非天然二硫鍵的引入和CDR的移植。通過這些策略開發(fā)出在極端條件下仍能保持結(jié)合能力的穩(wěn)定Nbs,從而為生物技術(shù)、檢測、診斷和治療應(yīng)用提供高性能的試劑。

選擇普健生物納米抗體(nanobodies,Nbs)的優(yōu)勢

普健生物可以提供針對特定靶點的特異性納米抗體定制服務(wù),包括抗原檢測,羊駝免疫,采血,效價檢測,納米抗體噬菌體庫構(gòu)建及淘選,特異性高親和力納米抗體篩選,表達(dá),檢測一條龍服務(wù)。親和力可以達(dá)到108~1010M級別。

自建養(yǎng)殖基地:每年近百頭成年羊駝用于免疫,穩(wěn)定提供大量的免疫抗原

庫容大:近千億級別天然庫

淘選周期短:最快在2周內(nèi)可完成針對各類靶點的特異性納米抗體快速篩選

親和力高:抗體親和力可達(dá)10-9M 級別

樣本來源豐富:免疫庫源自百余只不同種類的駝類樣本-羊駝(Alpaca )、駱駝(Camel)、美洲駝(Llama),提供更高抗體多樣性

超高品質(zhì):插入正確率100%,序列正確率97%,隨機選取200個克隆測序,均無重復(fù)序列

可構(gòu)建免疫庫,獲得更高親和力VHH序列

參考文獻(xiàn)

[1]Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature, 1993, 363(6428): 446-448

[2]Li C, Tang Z, Hu Z, et al. Natural single-domain antibody-nanobody: a novel concept in the antibody field. J Biomed Nanotechnol, 2018, 14(1): 1-19

[3]Steeland S, Vandenbroucke R E, Libert C. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today, 2016, 21(7): 1076-1113

[4]He T, Zhu J, Nie Y, et al. Nanobody technology for mycotoxin detection in the field of food safety: current status and prospects. Toxins, 2018, 10(5): 180

[5]Hoey R J, Eom H, Horn J R. Structure and development of single domain antibodies as modules for therapeutics and diagnostics. Exp Biol Med, 2019, 244(17): 1568-1576

[6]Liu M, Li L, Jin D, et al. Nanobody–a versatile tool for cancer diagnosis and therapeutics. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2021, 13(4): e1697

[7]Kunz P, Zinner K, Mücke N, et al. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Sci Rep, 2018, 8(1): 7934

[8]Akazawa-Ogawa Y, Takashima M, Lee Y H, et al. Heat-induced irreversible denaturation of the camelid single domain VHH antibody is governed by chemical modifications. J Biol Chem, 2014, 289(22): 15666-15679

[9]Hagihara Y, Mine S, Uegaki K. Stabilization of an immunoglobulin fold domain by an engineered disulfide bond at the buried hydrophobic region. J Biol Chem, 2007, 282(50): 36489-36495

[10]Turner K B, Liu J L, Zabetakis D, et al. Improving the biophysical properties of anti-ricin single-domain antibodies. Biotechnol Rep, 2015, 6: 27-35

[11]Zabetakis D, Olson M A, Anderson G P, et al. Evaluation of disulfide bond position to enhance the thermal stability of a highly stable single domain antibody. PLoS One, 2014, 9(12): e115405

[12]Melarkode V A, Shinada N K, Narwani T J, et al. Discrete analysis of camelid variable domains: sequences, structures, and in-silico structure prediction. PeerJ, 2020, 8: e8408

[13]Lefranc M P, Lefranc G. IMGT® and 30 years of immunoinformatics insight in antibody V and C domain structure and function. Antibodies, 2019, 8(2): 29

[14]Govaert J, Pellis M, Deschacht N, et al. Dual beneficial effect of interloop disulfide bond for single domain antibody fragments. J Biol Chem, 2012, 287(3): 1970-1979

[15]Vincke C, Muyldermans S. Introduction to heavy chain antibodies and derived nanobodies. Methods Mol Biol, 2012, 911: 15-26

[16]Kunz P, Ortale A, Mücke N, et al. Nanobody stability engineering by employing the Delta ΔTm shift; a comparison with apparent rate constants of heat-induced aggregation. Protein Eng Des Sel, 2019, 32(5): 241-249

[17]Mendoza M N, Jian M, King M T, et al. Role of a noncanonical disulfide bond in the stability, affinity, and flexibility of a VHH specific for the Listeria virulence factor InlB. Protein Sci, 2020, 29(4): 1004-1017