駝類動物體內(nèi)含有3種不同亞型的抗體，分別是常規(guī)抗體IgG1、天然缺失輕鏈及CH1恒定域的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HCAb）IgG2和IgG3。這種保留了全部抗原結(jié)合能力的天然無輕鏈及CH1區(qū)的單域抗體因其質(zhì)量?。s15 kDa，為IgG的十分之一），也被稱為納米抗體（nanobodies，Nbs）或VHH抗體（variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody）。與傳統(tǒng)抗體片段如抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）和單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）相比，納米抗體（nanobodies，Nbs）具有多個明顯的優(yōu)勢，比如免疫原性弱、生產(chǎn)成本低、水溶性好、組織滲透性好、穩(wěn)定性與親和力較高等。正是這些優(yōu)良特性使得納米抗體（nanobodies，Nbs）在生物技術(shù)方面得到了非常廣泛的應(yīng)用。

Structures and molecular mass of three different subtypes of antibodies and antibody fragments in camelid animals

 

對于大多數(shù)應(yīng)用而言，穩(wěn)定性是制約抗體應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。一方面抗體在其生產(chǎn)、運輸、儲存及使用的過程中容易發(fā)生多種物理和化學(xué)降解，另一方面抗體的不穩(wěn)定性聚集會潛在地影響產(chǎn)量、保質(zhì)期和免疫原性等應(yīng)用參數(shù)。因此抗體的穩(wěn)定性不僅會影響其生物學(xué)和生化評估，還會影響純化、儲存以及配方設(shè)計和生產(chǎn)。在各種類型的抗體中，納米抗體（nanobodies，Nbs）顯示出極好的溶解性，并且對高溫和化學(xué)變性具有顯著的抗性，可以很大程度地克服傳統(tǒng)抗體片段scFv的聚集和降解等穩(wěn)定性問題，是許多應(yīng)用的理想選擇。

納米抗體（nanobodies，Nbs）與常規(guī)抗體可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）的空間結(jié)構(gòu)相似，其框架是由9個反向平行的β折疊片層（A-B-C-D-E-F-G-H-I）通過鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起組成。在此結(jié)構(gòu)中，3個CDR分別連接BC、DE和HI鏈，并靠N端形成連續(xù)表面，與抗原表位的表面互補。連接CDR之間的氨基酸序列相對比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R）。幾乎所有納米抗體（nanobodies，Nbs）結(jié)構(gòu)都含有一個連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵，該鍵跨越蛋白質(zhì)的內(nèi)部，將兩個β鏈連接起來，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。部分納米抗體（nanobodies，Nbs）還含有一個可限制CDR環(huán)柔韌性和構(gòu)象自由度的額外二硫鍵。

 

Structure of Nbs

 

 

傳統(tǒng)抗體VH和VL通過疏水作用力來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并共同構(gòu)成抗原結(jié)合區(qū)。與之相比，納米抗體（nanobodies，Nbs）僅含有3個可變區(qū)，盡管與抗原結(jié)合界面的表面積減少，但其仍具有較高的穩(wěn)定性與親和力。

它主要通過以下兩種方式來適應(yīng)輕鏈的缺失：

一、大量的親水性氨基酸取代先前與CH1、VL結(jié)合界面的脂肪族殘基（L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L），且部分FR2被拉伸扭轉(zhuǎn)的CDR3環(huán)覆蓋，避免與外界水環(huán)境的接觸，從而防止納米抗體（nanobodies，Nbs）的二聚化，其CDR3環(huán)越長，納米抗體（nanobodies，Nbs）越穩(wěn)定。另外還可在CDR3末端形成疏水核心，有利于穩(wěn)定Nbs的折疊結(jié)構(gòu)域。

二、納米抗體（nanobodies，Nbs）的CDR1和CDR3普遍比VH的長，潛在地增加了互補位構(gòu)象的多樣性，從而以高度的形狀表面互補性與相應(yīng)的抗原結(jié)合，一定程度上彌補了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降以及因尺寸小而導(dǎo)致的潛在序列多樣性降低。

納米抗體（nanobodies，Nbs）的小分子和單域?qū)傩再x予了其比常規(guī)抗體更為穩(wěn)定的特性，然而并非所有的納米抗體（nanobodies，Nbs）都具有很好的熱穩(wěn)定性與化學(xué)穩(wěn)定性。在以往研究的多個納米抗體（nanobodies，Nbs）中，大約有2/3的納米抗體（nanobodies，Nbs）在65℃處理后發(fā)生了不可逆的聚集，但是部分納米抗體（nanobodies，Nbs）在90℃高溫處理后仍具有90%的活性。這些穩(wěn)定性差異的根本原因在于納米抗體（nanobodies，Nbs）特殊結(jié)構(gòu)的差異，包括氨基酸序列、二硫鍵的數(shù)量與位置、結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象等。

那么，如何構(gòu)建穩(wěn)定性更高、親和力更強的納米抗體（nanobodies，Nbs）呢？普健生物深耕蛋白抗體領(lǐng)域15余年，在高質(zhì)量納米抗體（nanobodies，Nbs）制備技術(shù)上擁有自主核心技術(shù)，與知名科研單位、研究院所、醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)成功合作相關(guān)項目20000+。在納米抗體的制備方面，動物的選擇是免疫成功的關(guān)鍵，普健生物自建養(yǎng)殖基地，每年近百頭成年羊駝用于免疫，穩(wěn)定提供大量的免疫抗原。通過設(shè)計目標(biāo)抗原對健康強壯、精神良好、體型適中的羊駝進(jìn)行四輪免疫后進(jìn)行效價檢測，當(dāng)血清免疫效價達(dá)到預(yù)期后，再提取總RNA用于噬菌體文庫的構(gòu)建，利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選得到高特異性和強親和力的納米抗體。

 

 

 

此外，普健生物還可根據(jù)科研需求，在分子設(shè)計時選擇性加入功能區(qū)或基于納米抗體（nanobodies，Nbs）結(jié)構(gòu)特征采用合理的設(shè)計方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化，例如共有序列驅(qū)動的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、非天然二硫鍵的引入和CDR的移植。通過這些策略開發(fā)出在極端條件下仍能保持結(jié)合能力的穩(wěn)定Nbs，從而為生物技術(shù)、檢測、診斷和治療應(yīng)用提供高性能的試劑。

選擇普健生物納米抗體（nanobodies，Nbs）的優(yōu)勢

普健生物可以提供針對特定靶點的特異性納米抗體定制服務(wù)，包括抗原檢測，羊駝免疫，采血，效價檢測，納米抗體噬菌體庫構(gòu)建及淘選，特異性高親和力納米抗體篩選，表達(dá)，檢測一條龍服務(wù)。親和力可以達(dá)到108~1010M級別。

自建養(yǎng)殖基地：每年近百頭成年羊駝用于免疫，穩(wěn)定提供大量的免疫抗原

庫容大：近千億級別天然庫

淘選周期短：最快在2周內(nèi)可完成針對各類靶點的特異性納米抗體快速篩選

親和力高：抗體親和力可達(dá)10-9M 級別

樣本來源豐富：免疫庫源自百余只不同種類的駝類樣本-羊駝（Alpaca ）、駱駝（Camel）、美洲駝（Llama），提供更高抗體多樣性

超高品質(zhì)：插入正確率100%，序列正確率97%，隨機選取200個克隆測序，均無重復(fù)序列

可構(gòu)建免疫庫，獲得更高親和力VHH序列

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