納米抗體衍生于駱駝科動(dòng)物的重鏈抗體，是目前多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的重要工具。當(dāng)前獲得納米抗體的主要方法是構(gòu)建羊駝納米抗體噬菌體展示文庫(kù)，通過(guò)抗原淘選，從噬菌體展示文庫(kù)中淘選出高親和力的納米抗體。

        在本綜述中，我們探討了推動(dòng)納米抗體設(shè)計(jì)與優(yōu)化的結(jié)構(gòu)特征、功能屬性及計(jì)算方法。我們分析了其獨(dú)特的抗原結(jié)合域，強(qiáng)調(diào)了互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）在目標(biāo)識(shí)別及其特異性中的關(guān)鍵作用。此外，本綜述還從生物學(xué)角度闡述了納米抗體相對(duì)于傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢(shì)，包括其小尺寸、高穩(wěn)定性和良好溶解性，這些特性使其成為診斷、治療和生物傳感中高效低成本的抗原捕獲抗體。

圖1. 常規(guī)抗體，單鏈抗體和納米抗體

        傳統(tǒng)全長(zhǎng)抗體存在于人類及其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的Y形分子（如圖1所示）。每個(gè)抗體由兩條相同的重鏈（包含VH、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）和兩條相同的輕鏈（包含VL和CL結(jié)構(gòu)域）組成。重鏈的恒定區(qū)CH2和CH3構(gòu)成Fc區(qū)域。Y形結(jié)構(gòu)的兩個(gè)“臂”被稱為抗原結(jié)合片段（Fab區(qū)），由兩個(gè)重鏈可變區(qū)（VH）和兩個(gè)輕鏈可變區(qū)（VL）以及兩個(gè)恒定區(qū)（CH1和CL）組成。

        抗原結(jié)合位點(diǎn)，也稱為抗原決定簇，位于抗體“臂”的末端，處于由重鏈（VH）和輕鏈（VL）的可變區(qū)形成的口袋或槽中。這些結(jié)合位點(diǎn)由六個(gè)超變?nèi)ソM成，通常稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。重組的抗體片段，如Fab片段、scFv、納米抗體（如圖1所示）及多價(jià)工程化變體，是有效的抗原結(jié)合分子。這些片段保留了完整單克隆抗體的靶向特異性，同時(shí)提供了適合各種診斷和治療應(yīng)用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。它們被廣泛用于體外成像和診斷的示蹤劑、生物傳感器的開(kāi)發(fā)，以及靶向癌癥和SARS-CoV-2等多種疾病的治療手段。

        納米抗體（Nanobodies），也稱為VHH或單域抗體，由于缺少輕鏈，是從僅有重鏈的抗體中衍生出來(lái)的小型抗體片段。1993年首次在駱駝血清中被報(bào)道發(fā)現(xiàn)，但在其他駱駝科動(dòng)物如羊駝、美洲駝以及鯊魚(yú)體內(nèi)也存在。普健生物可提供駱駝，羊駝，美洲駝三種駝科動(dòng)物的天然噬菌體展示文庫(kù)淘選和免疫噬菌體展示文庫(kù)淘選服務(wù)。天然噬菌體展示文庫(kù)淘選得到的序列重組表達(dá)后親和力可以達(dá)到10^-9 M級(jí)，免疫噬菌體展示文庫(kù)淘選得到的序列重組表達(dá)后親和力可以達(dá)到10^-10 M級(jí)。

        納米抗體僅有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），其可單獨(dú)作為抗原結(jié)合區(qū)域，并且其結(jié)合親和力與單克隆抗體相當(dāng)。納米抗體甚至能夠與隱蔽表位相互作用，這些表位是傳統(tǒng)抗體無(wú)法接觸到的，例如酶活性位點(diǎn)以及SARS-CoV-2刺突蛋白中的表位。與抗體類似，納米抗體也含有免疫球蛋白樣的β-夾層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由反平行的β-鏈組成，并排列成兩個(gè)片層，由內(nèi)部的二硫鍵保持其穩(wěn)定性（如圖1）。這種結(jié)構(gòu)框架為構(gòu)成結(jié)合表面的三個(gè)CDR區(qū)提供了穩(wěn)定性。這些CDR區(qū)的長(zhǎng)度、組成和結(jié)構(gòu)具有可變性，其中CDR3的序列變異性最大，長(zhǎng)度范圍為12至18個(gè)殘基，因此被認(rèn)為是抗原結(jié)合特異性的重要貢獻(xiàn)者之一。值得注意的是，納米抗體通常具有比抗體更長(zhǎng)的CDR3區(qū)，并且可以采用連接或擴(kuò)展的構(gòu)象，使納米抗體能夠通過(guò)手指狀的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入常規(guī)抗體無(wú)法接觸的結(jié)合口袋。因此，納米抗體中的CDR3區(qū)占據(jù)的構(gòu)象空間比抗體中的更大，因?yàn)槠洳皇芘c配對(duì)輕鏈域的限制。納米抗體的CDR3區(qū)通常貢獻(xiàn)了整個(gè)結(jié)合位面超過(guò)50%的結(jié)合相互作用。納米抗體的其余部分由四個(gè)區(qū)域組成，其序列和結(jié)構(gòu)比常規(guī)抗體更為保守，稱為框架區(qū)（framework regions）。納米抗體中對(duì)應(yīng)常規(guī)抗體VH-VL界面的區(qū)域表現(xiàn)出比其他抗體片段（如Fab和scFv）更高的親水性，這一特性減少了自我結(jié)合或二聚化的可能性，從而確保納米抗體保持單體狀態(tài)?？傮w而言，納米抗體的結(jié)合位面在結(jié)構(gòu)片段、用于抗原相互作用的殘基以及與抗原建立的接觸種類方面表現(xiàn)出比常規(guī)抗體更大的多樣性。

        與傳統(tǒng)抗體（分子量約150 kDa）相比，納米抗體具有多種優(yōu)勢(shì)，包括較小的分子量（約110個(gè)氨基酸，分子量約12–15 kDa）、出色的穩(wěn)定性和良好的溶解性，同時(shí)仍能保持與傳統(tǒng)抗體相似的高親和力結(jié)合能力。此外，納米抗體因其優(yōu)異的生化特性——如高熱穩(wěn)定性、強(qiáng)組織滲透性和低免疫原性——而備受關(guān)注。納米抗體還可以通過(guò)細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)以經(jīng)濟(jì)高效的方式大量生產(chǎn)，納米抗體可以通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)分泌到周質(zhì)空間表達(dá)成功。但是，相比之下，較昂貴的真核表達(dá)系統(tǒng)(如普健生物的XtenCHO哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)得到的納米抗體通常具有更高的生物學(xué)活性。由于這些有利特性，納米抗體及其衍生物在許多生化應(yīng)用中正逐步替代傳統(tǒng)抗體。此外，納米抗體還作為新型工具，解決了傳統(tǒng)抗體無(wú)法應(yīng)對(duì)的研究挑戰(zhàn)。例如，納米抗體被用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)及其動(dòng)態(tài)性，甚至能夠調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)。它們還被用作載體蛋白，用于便捷地檢測(cè)與免疫檢查點(diǎn)蛋白程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合的肽。諸如Legobodies（由納米抗體、Fab片段和融合蛋白組成的復(fù)合體）和Megabodies（將納米抗體嫁接到球形剛性細(xì)菌蛋白上）等新型復(fù)合體被用來(lái)通過(guò)單顆粒冷凍電子顯微鏡解析小蛋白的結(jié)構(gòu)，從而增加粒子分子量。
        納米抗體通常通過(guò)免疫動(dòng)物（如羊駝或駱駝）來(lái)獲得，即將目標(biāo)抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)構(gòu)建和淘選噬菌體展示文庫(kù)的方法獲得抗體序列。然而，隨著定向進(jìn)化技術(shù)的進(jìn)步，納米抗體庫(kù)現(xiàn)在可以完全通過(guò)合成方法構(gòu)建噬菌體展示突變文庫(kù)，在幾周內(nèi)生成。這些噬菌體展示文庫(kù)的主要差異通常體現(xiàn)在CDR-H3長(zhǎng)度上，形成了三種獨(dú)特的相互作用表面：凹面、突出環(huán)和凸形結(jié)合面。這些庫(kù)可用于選擇與目標(biāo)蛋白結(jié)合的分子，包括膜蛋白以及稀有構(gòu)象狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。
        除了在基礎(chǔ)生化研究中的廣泛應(yīng)用外，納米抗體也越來(lái)越多地被用作診斷工具、分子成像探針和治療劑。目前，納米抗體正用于多種人類疾病的臨床研究，涵蓋乳腺癌、腦腫瘤、肺部疾病和傳染病等病癥。納米抗體還能夠靶向各種腫瘤，并已應(yīng)用于前列腺癌的診斷和治療。自2019年以來(lái)，特別是在新冠疫情期間，許多研究（包括計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)）開(kāi)始探索納米抗體作為抗病毒劑的潛力。納米抗體被工程化設(shè)計(jì)以特異性靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結(jié)合域（RBD），包括針對(duì)奧密克戎變種的設(shè)計(jì)，從而阻止病毒與人體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的相互作用。通過(guò)與刺突蛋白結(jié)合，納米抗體干擾了病毒感染人體細(xì)胞的能力，并有可能中和其傳染性。

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參考文獻(xiàn)：Nanobody engineering: computational modelling and design for biomedical and therapeutic applications