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一、概述
親和力是判定分子間相互作用的重要參數(shù)，是了解分子以及藥物的發(fā)現(xiàn)與篩選等的重要指標(biāo)。對(duì)于藥效的評(píng)價(jià)、生物大分子及其復(fù)合體的穩(wěn)定性的評(píng)估需要從動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和熱穩(wěn)定性等方面進(jìn)行：包括分子間的結(jié)合、結(jié)合的快慢、結(jié)合的強(qiáng)弱、結(jié)合的機(jī)理等多方面的全面性研究。
普健生物提供的表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)服務(wù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白，抗體、多肽、核酸及小分子化合物等相互作用的定性定量分析，也可以對(duì)細(xì)胞裂解液、文庫(kù)樣本等依托LSPR-Selex技術(shù)垂釣篩選未知靶標(biāo)。
SPR芯片工作原理示意圖
二、服務(wù)內(nèi)容
| 服務(wù)內(nèi)容 | 交付內(nèi)容 |
服務(wù)周期 |
| 樣本準(zhǔn)備(可選) | 蛋白/抗體/多肽/核酸/小分子等 | / |
| 親和力測(cè)定 | 親和力檢測(cè)報(bào)告;結(jié)合常數(shù)(Ka)、解離常數(shù)(Kd)、親和常數(shù)(KD);響應(yīng)曲線;親和力強(qiáng)弱排序 | 2-3周 |
三、實(shí)驗(yàn)流程
1、按照 OpenSPRTM 儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序安裝 NTA 芯片。
2、開(kāi)始以最大流速(150 µL/min)運(yùn)行，檢測(cè)緩沖液PBS(pH7.4)。
3、達(dá)到信號(hào)基線后，調(diào)整緩沖液的流速到20 µL/min。
4、開(kāi)始激活芯片，取出制備好的咪唑和NiCl2 溶液，通過(guò)進(jìn)樣口注入，與傳感器相互作用5min完成芯片表面功能化，準(zhǔn)備配體。
5、用激活緩沖液稀釋用于固定的配體， 體積為200µL濃度為10-50µg/mL ，通過(guò)進(jìn)樣口注入相互作用4 min。
6、觀察基線5 min，以確保穩(wěn)定。
7、通過(guò)比較注入配體前后的信號(hào)測(cè)量配體結(jié)合的量。如果需要更多的配體，可以再次注入配體。
8、配體信號(hào)穩(wěn)定之后，開(kāi)始注入高濃度的分析物，以確認(rèn)配體的活性，并確認(rèn)表面大致的最大結(jié)合能力。
9、將流速提高到150 µL/min，注入適當(dāng)?shù)脑偕彌_液，以去除分析物。
10、分析物用緩沖液稀釋，濃度詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以20 µL/min 上樣，蛋白與配體結(jié)合時(shí)間均為240 s;自然解離420 s。
11、本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果所使用分析軟件為：TraceDrawer (Ridgeview Instruments ab, Sweden)，分析方法是 One To One 分析模型。
四、結(jié)果分析
動(dòng)力學(xué)及親和力參數(shù)
|
參數(shù) |
釋義 | 結(jié)果 |
| ka (1/(M*s)) | 結(jié)合速率常數(shù) | 2.82e5 |
| kd (1/s) | 解離速率常數(shù) | 4.16e-4 |
| KD (M) | 解離平衡常數(shù)，也叫親和力常數(shù) | 1.48e-9 |
結(jié)果說(shuō)明：靶蛋白跟 Gidn 的親和力為48 nM.
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