上期推文《終于有人把主流的單抗開發(fā)平臺總結(jié)清楚了?》中，小編和大家介紹了各種高效且目前主流的單抗開發(fā)平臺，從本篇開始，讓我們一起關(guān)注這些更具獨特性的抗體制備方法和抗體應(yīng)用方向。

泛素和泛素化

　　泛素(ubiquitin，Ub)是一種小分子多肽，由76個氨基酸組成并廣泛分布于真核細胞中。其主要功能是非底物特異性的標記需要降解的蛋白質(zhì)，主要存在形式包括：游離的泛素、多泛素鏈、泛素化蛋白;不同形式存在的泛素含量反映了細胞的不同生理狀態(tài)。

不同類型的泛素化

　　泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶(如泛素激活酶、結(jié)合酶、連結(jié)酶、降解酶等)的作用下，將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進行分類，篩選出靶蛋白分子并對其進行特異性修飾的過程。由于泛素化的多樣性與多價性，泛素化廣泛參與包括細胞增殖、分化、凋亡、自噬、DNA損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等各種生理過程，是近年來生物化學研究的一個重大成果，已成為新藥開發(fā)的主要方向之一。

泛素化的具體過程

　　泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應(yīng)：

　　在ATP供能的情況下E1粘附在泛素分子尾部活化泛素分子生成Ub-E1復(fù)合體，E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2酶上形成Ub-E2復(fù)合體。隨后，E2酶和一些種類不同的E3酶共同識別靶蛋白，對其進行泛素化修飾。根據(jù)E3與靶蛋白的相對比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。

泛素化過程(Stone, Sophia L., 2019)

E1：泛素激活酶E1;E2：泛素偶聯(lián)酶E2;E3：泛素連接酶E3;

Target：靶蛋白;Ubiquitin：泛素;DUBs：去泛素化酶。

　　P.S.單個泛素分子以其C-末端賴氨酸與靶蛋白的一個Lys側(cè)鏈相連叫做單泛素化，與多個賴氨酸殘基相連叫做多泛素化。如果靶蛋白的單個Lys殘基被多個泛素分子標記則稱為多聚泛素化。

　　簡而言之，也就是在E1、E2、E3三類酶的順序催化下，泛素被以特異性的方式連接到靶標蛋白質(zhì)或靶標蛋白質(zhì)上已連接的泛素鏈上，其中E3泛素化連接酶決定靶蛋白的特異性識別。蛋白質(zhì)泛素化的結(jié)果是使得被標記的蛋白質(zhì)被蛋白酶分解為較小的多肽、氨基酸以及可以重復(fù)使用的泛素。

泛素化抗體的應(yīng)用

　　自泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在20世紀80年代初被發(fā)現(xiàn)以來，與其相關(guān)的研究成果層出不窮。泛素對細胞的生命活動不可或缺，但由于泛素化的復(fù)雜性，人們目前的認知也只是冰山一角，很多問題仍有待研究。泛素化抗體適用于檢測不同形式的泛素，以幫助科研人員了解細胞在生命活動中差異顯著的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，研究這些變化的規(guī)律，可幫助科研人員準確定位泛素化靶點和靶向相關(guān)疾病的治療。例如，診斷阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和成對螺旋絲，帕金森病中的路易小體，以及尼曼-匹克病中的匹克小體都是高度泛素化的，可以很容易地用泛素抗體檢測到。

如何檢測蛋白是否泛素化

　　1、免疫沉淀反應(yīng)

　　通過免疫共沉淀方法分離特定蛋白質(zhì)及其結(jié)合蛋白(包括被泛素化修飾的蛋白)。分離出的蛋白經(jīng)SDS電泳后用泛素抗體進行western blot分析，可以鑒定具體哪個蛋白發(fā)生了泛素化修飾以初步判斷某蛋白具有泛素化功能。

　　2、體外泛素標記突變位點

　　將研究蛋白(被泛素化的蛋白)通過蛋白提取試劑盒提取內(nèi)源性蛋白或通過基因工程技術(shù)重組表達后提純。用k63或k48連接的泛素鏈肽段系列酶E1、E2、E3在適當條件下體外孵育，然后用泛素抗體進行western blot分析。該方法可以明確所研究蛋白的哪個賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。

　　3、體外泛素化實驗

　　將待研究蛋白A(被泛素化的蛋白)與UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及待研究的蛋白B(具有泛素連接酶E3活性)在體外反應(yīng)緩沖液中共同進行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進行IP和WB分析。該方法可以明確B蛋白具有E3連接酶活性且是引起A蛋白發(fā)生泛素化修飾的關(guān)鍵因素。

　　普健生物除可進行常規(guī)的單抗、多抗制備外，還可定制如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修飾性抗體，抗體制備經(jīng)驗豐富，抗體發(fā)現(xiàn)平臺完善。