很多人不知道,抗體藥物研發(fā),最關(guān)鍵的一步是。。。
咨詢,問對人很重要
一個雙特異性抗體藥與普健的故事,四年征程,未完待續(xù)。。。
那是風和日麗的一個下午,叮咚~
一條消息跳了出來,“要開發(fā)雙特異性抗體藥物,你們有專家嗎?”
“我們的抗體藥物專家經(jīng)驗豐富,曾經(jīng)成功開發(fā)過上市治療性抗體藥物,可以針對具體需求進行個性化設(shè)計。AtaGenix將全程為您服務(wù)。”
隨后,一項歷時四年的工程由此展開。
目標:開發(fā)一種雙特異性抗體藥物,通過連接CD3抗體,增強針對某類特定腫瘤細胞A的免疫系統(tǒng)識別能力。
要開發(fā)雙特異性抗體,我們得先分別獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和腫瘤抗原A的抗體。然后進行雙特異性抗體設(shè)計、表達及純化,對正確組裝后的雙抗進行檢測,最終實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
路得一步一步走,每一步都很關(guān)鍵。
這就需要我們的單克隆抗體開發(fā)技術(shù)(點擊可查看技術(shù)詳情)。
已知目標蛋白在哺乳動物表達系統(tǒng)里很難表達,但我們就是解決困難的。
接下來,沿著單克隆抗體開發(fā)流程,看一下我們是怎樣做到的。
經(jīng)過預測和評估,我們選擇了目標蛋白的一個片段在哺乳動物細胞中進行表達。
雖然,該基因是針對哺乳動物細胞表達而設(shè)計和優(yōu)化的。
但是,我們向來不只做單一準備,永遠備有為客戶準備的Plan B。So,除了哺乳動物細胞表達系統(tǒng),我們還選了大腸桿菌作為備用系統(tǒng)。兩種表達方案同時進行,最終獲得滿足條件的抗原。
用原始抗原免疫五只小鼠,并篩選陽性血清。
為了篩選到符合要求的抗體,我們將綠色熒光蛋白GFP與抗原蛋白在哺乳動物細胞中融合表達,通過FITC信號將表達GFP的細胞篩選出來,作為流式分析抗體特異性的陽性細胞;并使用能夠識別GFP的一抗作為陽性抗體對照,來篩選特異性抗體。
流式分析檢測結(jié)果(GFP抗體和GFP陽性細胞百分比):
流式檢測中對抗原免疫原性最強的為3號小鼠血清,4號次之,我們決定對小鼠3號和4號進行融合。
將篩選出的兩只小鼠脾細胞分別進行融合、亞克隆,F(xiàn)C檢測保留最佳陽性抗體,最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜交瘤細胞株。
看一下我們都做了哪些工作?
a. 對3號小鼠細胞融合后的上清,進行ELISA檢測,從中篩選出42株陽性細胞株(下表)。
b. 對3號小鼠細胞融合后的上清,進行FC檢測,從中篩選出14株陽性細胞株(下表)。
c. 生產(chǎn)的抗體,進行FC檢測,從中篩選出30株陽性細胞株(下表)。
小結(jié)
經(jīng)過多系統(tǒng)表達測試,我們成功地在哺乳動物細胞中重組表達了目標抗原,開發(fā)出對抗原具有良好親和力和特異性的單克隆抗體。最終,我們生產(chǎn)并純化得到了30株抗腫瘤抗原A抗體的單克隆細胞株,產(chǎn)生的抗體均可以在流式細胞術(shù)中成功識別抗原。
抗腫瘤抗原A雜交瘤測序獲得鼠單抗的VH和VL序列。
做了8個嵌合抗體的表達純化,將8個嵌合抗體和1個原始雜交瘤細胞純化得到的抗體進行ELISA驗證,用Biacore檢測了這9個抗體的親和力,篩選到了高親和力的嵌合抗體。
表達了18個人源化抗體,將18個人源化抗體、原始雜交瘤細胞純化得到的抗體及篩選得到的最佳嵌合抗體,進行ELISA驗證,用Biacore檢測了這20個抗體的親和力,篩選得到高親和力抗體。
接下來,是最關(guān)鍵的一步。別眨眼哦!
目標:抗腫瘤抗原A和CD3的雙特異性抗體
我們已獲得3個抗腫瘤抗原A抗體,1個抗CD3抗體。
AB1(前期項目中開發(fā)并測序的小鼠雜交瘤單克隆抗體)
AB2和AB3(通過噬菌體展示開發(fā)的人源單克隆抗體)
AB4 (AB4h)是在專利中公開的的抗CD3人源化抗體
我們的抗體設(shè)計專家設(shè)計了3種類型的雙特異性抗體,即CrossMAb,IgG-like format using DuoBodies,and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。
將cDNA序列亞克隆到AtaGenix特有的哺乳動物細胞表達載體pTXs1中,本項目共使用21個表達質(zhì)粒(下表):
總共16種抗腫瘤抗原A和抗CD3的重組抗體片段用于測試。
表達測試結(jié)果如下:
CrossMAbs類型重組抗體表達純化測試
結(jié)果表明,CrossMAbs是表達的,但沒有以完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)組裝,處于半形成狀態(tài)。
DuoBodies類型重組抗體表達純化測試
No.7: AB1重組抗體;No.8: AB2重組抗體;No.9: AB3重組抗體;No./10: AB4重組抗體
Bivalent Fab-Fab類型重組抗體表達純化測試
重組抗體QC結(jié)果(還原膠和非還原膠)
結(jié)果顯示,對于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體類型,正確地產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)。
值得一提的是,我們整個表達純化過程對內(nèi)毒素進行了有效的控制和去除,將內(nèi)毒素控制在<0.1EU/mg。
上面獲得的DuoBodies類型重組抗體,目前只能特異識別單一抗體,如何將兩種抗體組合連接,就需要神奇的Fab臂交換技術(shù)。
通過特定的條件,進行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和抗CD3抗體,形成雙特異性抗體。
對交換重組的雙特異性抗體進行檢測:
重組DuoBodies抗體QC結(jié)果(還原膠和非還原膠)
1:No.7+No./10;2:No.8+No./10;3:No.9+No./10
重組DuoBodies抗體產(chǎn)量及純度
5.1)SEC-HPLC Analysis
SEC-HPLC檢測結(jié)果表明,No.7+No./10重組雙特異性抗體濃度最高,是由兩個重鏈和兩個輕鏈組成的理想雜合四聚體。No.8+No./10重組抗體有一些降解或未組裝完全,No.9+No./10重組抗體顯著降解或組裝較少。
5.2)ELISA滴定
ELISA滴定法同時測定雙特異性抗體和以前獲得的親本抗體(AB1、AB2和AB3)對腫瘤抗原A和CD3的結(jié)合能力。
針對腫瘤抗原A結(jié)合檢測
針對CD3結(jié)合檢測
檢測結(jié)果顯示,所有陽性對照與預期一致。
DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和CD3結(jié)合良好,說明這兩類重組雙特異性抗體構(gòu)建正確。雖然CrossMAbs類型抗體也會結(jié)合,但它們的結(jié)合很可能是由半合成狀態(tài)的抗體造成的。
項目的順利推動,其中包含2000多封郵件溝通,30多個技術(shù)人員辛勤實驗,歷時4年,中法科學家通力合作。
目前,其中一個雙特異性抗體已經(jīng)完成開發(fā),生產(chǎn)并交付客戶1.237g抗體。接下來,客戶計劃采用我們擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的細胞株進行穩(wěn)定細胞株構(gòu)建,后續(xù)事宜正在商定中。