種類 | 研究對象 | 結合技術 |
---|---|---|
染色質(zhì)免疫沉淀 (CHIP) |
DNA-蛋白質(zhì) | PCR |
蛋白質(zhì)免疫沉淀 (PIP) |
抗原-抗體 | 蛋白免疫印跡 |
放射免疫沉淀 (RIP) |
抗原-抗體 | 放射性同位素技術 |
當然,再結合其他技術還可以衍生出更多的技術,本篇先來剖析一下染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)。
染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。其原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物,并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段。后期通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
應用:ChIP可以用來檢測體內(nèi)反式作用因子與DNA的動態(tài)作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且,ChIP與其他方法的結合擴大了其應用范圍:ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;ChIP與體內(nèi)足跡法相結合,用于尋找反式因子的體內(nèi)結合位點;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。
甲醛處理細胞
收集細胞,超聲破碎
加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合
加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,沉淀
對沉淀下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合
洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物
解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷
PCR或基因芯片分析
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翹首以待實驗成果
然后有人歡喜有人憂
怎么把“驚嚇”變成“驚喜”
this is a question
只要找到破解方法,
所有的問題都不是問題!
今天我們就來一一擊破
免疫沉淀系列實驗中那些揪心的問題。
原因 | 方案 |
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洗滌不充分 | 離心前蓋上管蓋反復顛倒幾次 |
抗體濃度太高 | 檢查推薦抗體用量,嘗試使用更少的抗體 |
抗體特異性不夠 | 使用親和純化的抗體,最好預先吸收 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉時間/溫度,室溫封閉1小時或4℃封閉過夜 |
封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應 | 換一種不同的封閉液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉,牛奶含生物素 |
操作設備被污染 | 保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔,無外源污染物 |
原因 | 方案 |
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蛋白未轉(zhuǎn)到膜上 | 可以用麗春紅染膜并結合染膠(考馬斯亮藍)后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭;適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流 |
一抗、二抗等不匹配 | 選擇針對一抗來源的種屬抗體 |
過度封閉 | 使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶的抗體稀釋液;試用不同的封閉液;減少封閉時間 |
洗膜過度 | 洗膜時間不宜過長,加入的去垢劑不宜過強或過多,建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20 |
曝光時間太短 | 延長膠片的曝光時間,超感應化學發(fā)光底物會持續(xù)發(fā)光至少6個小時 |
原因 | 方案 |
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細胞傳代次數(shù)過多,蛋白表達模式分化 | 使用原始或傳代少的細胞株或進行平行實驗 |
樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 |
使用新鮮制備的標本并使用蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作 |
一抗不純 | 使用單克隆或親和純化的抗體,減少非特異條帶 |
一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體 |
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