隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,全球化資源整合為生物制藥行業(yè)提供了越來越全面的技術(shù)支撐,抗體藥物的發(fā)展也獲得越來越多的重視。抗體藥物開發(fā)是一個非常繁雜的過程,而穩(wěn)定細胞株適用于抗體藥開發(fā)的各個階段,如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、檢測分析、功能性研究等等。構(gòu)建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達細胞株是第一步也是關(guān)鍵步驟之一。
普健生物在重組蛋白表達、抗體生產(chǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等方面有著10余年經(jīng)驗。今天小普與大家分享一種基于CHO細胞株構(gòu)建的高效抗體藥開發(fā)策略,能顯著提高細胞株開發(fā)效率,實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的細胞株開發(fā)。
哺乳動物細胞是用于生產(chǎn)單抗在內(nèi)的商業(yè)化治療性蛋白產(chǎn)品的主要宿主細胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細胞,因為與其他系統(tǒng)相比,CHO細胞具有以下優(yōu)點:
①CHO 細胞對蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能,因此其表達的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白;
②CHO 細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強,可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式;
③整合外源基因后的細胞穩(wěn)定,重組基因能高效擴增和表達;
④表達目的蛋白可由細胞內(nèi)運輸?shù)郊毎?并且CHO 細胞只表達少量的內(nèi)源蛋白,有利于目的蛋白的提取。
哺乳動物細胞的培養(yǎng)生長過程需要谷氨酰胺(L-glutamine),谷氨酰胺合成酶(GS)將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺,哺乳動物細胞通過這一酶促反應(yīng)獲得谷氨酰胺。
CHO細胞內(nèi)源的谷氨酰胺合成酶活性比較低,需要在培養(yǎng)基中額外添加外源谷氨酰胺才能促進細胞生長。利用GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine,MSX)抑制內(nèi)源性GS活性,用含目的基因和GS基因標(biāo)記的表達載體,轉(zhuǎn)染宿主CHO細胞,通過MSX加壓篩選,促使GS基因和目的蛋白基因擴增,只有轉(zhuǎn)染了額外GS基因的細胞才可以在不含有谷氨酰胺(L-glutamine)的培養(yǎng)基中生長,從而篩選獲得重組表達細胞株。
工業(yè)上主要使用兩大類CHO細胞:
①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005),CHOK1SV(lonza);
②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。
細胞轉(zhuǎn)染是將外源分子(如DNA,RNA)導(dǎo)入真核細胞,細胞株篩選方案包括一系列步驟:
選擇適合的信號肽,對抗體重輕鏈基因進行密碼子優(yōu)化。將目的基因構(gòu)建到普健專有的GS載體上。
使用普健生物專利(2019111820312、201910992950X、202111448761x、202211173542X)的CHO細胞轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后,加壓篩選Minipools。利用ELISA或Octet進行初篩,選取最優(yōu)的30個minipools,逐級擴大培養(yǎng)至TPP搖管中,利用簡單的流加表達工藝篩選出3個最優(yōu)的minipools。
采用特定的有限稀釋方法鋪板,Imager跟蹤成像。利用ELISA或Octet進行初篩,選取最優(yōu)的30個單克隆,逐級擴大培養(yǎng)至TPP搖管中,利用簡單的流加表達工藝篩選出10株最優(yōu)的單克隆。將10株最優(yōu)的單克隆傳至搖瓶中,利用特定的搖瓶工藝對10株單克隆進行細胞生長特性,代謝特性,產(chǎn)量,抗體糖基化修飾,抗體聚體等質(zhì)量分析,綜合篩選出最優(yōu)的3株生產(chǎn)用細胞株。
普健生物有多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,補料培養(yǎng)基及流加表達培養(yǎng)方案??梢愿鶕?jù)不同的細胞株生長特性,篩選出最優(yōu)的流加表達工藝。同時,也可以用特定的調(diào)糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同的糖型的比例。
主要包括:抗體效價、活性分析,抗體聚體分析,抗體糖基化分析,抗體效能分析等。
包括基因型穩(wěn)定性分析及30個代次的傳代穩(wěn)定性分析。
構(gòu)建生產(chǎn)重組抗體的CHO穩(wěn)定細胞株。
Fig.1 單克隆產(chǎn)量分析
Fig.2 流加表達測試產(chǎn)量優(yōu)化
Fig.3 抗體聚體分析(SEC-HPLC)
Fig.4 抗體親和力分析(Biacore)
Fig.5 細胞株穩(wěn)定性分析圖
XtenCHOTM高密度表達系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基相較于常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO培養(yǎng)基以及補料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時表達生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性價比高的特點。
普健生物擁有高效的CHO穩(wěn)定細胞株構(gòu)建體系,從上游的雜交瘤抗體測序,到序列優(yōu)化,人源化,再到細胞株構(gòu)建,個性化細胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測,整個技術(shù)體系成熟,儀器配備齊全,能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十余年的抗體藥物研發(fā)項目經(jīng)驗,自主開發(fā)了CHO-GS KO細胞系及GS載體系統(tǒng),抗體表達產(chǎn)量>3g/L以上。自主研發(fā)了CHO細胞專利轉(zhuǎn)染技術(shù),及提高抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定細胞株篩選技術(shù)。擁有完善的抗體質(zhì)量分析平臺,可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。
高產(chǎn):重組蛋白/抗體表達量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達。
穩(wěn)定:獨有的GS穩(wěn)轉(zhuǎn)系列載體配合MSX藥物篩選,實現(xiàn)穩(wěn)定傳代15-30代以上。
快速:篩選高產(chǎn)細胞株,周期短至3個月。
靈活定制:可針對重組蛋白/抗體全長或片段進行個性化表達。
經(jīng)驗豐富:專業(yè)的技術(shù)團隊,已成功為國內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細胞株。
多篩選系統(tǒng):G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng),GS/DHFR 篩選系統(tǒng)等。