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分類：
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient gene expression, TGE）和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stable gene expression，SGE)兩種。
指外源 DNA或RNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不整合到宿主染色體中進(jìn)行外源目的基因的表達(dá)。
特點(diǎn)：
1.目的基因未整合到染色體上，超螺旋質(zhì)粒DNA有較高的轉(zhuǎn)染效率；
2.轉(zhuǎn)染24h-72h后常需要用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白、β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)；
3.表達(dá)持續(xù)時(shí)間48-72h,隨細(xì)胞分裂而稀釋直至丟失；
4.用于快速分析:如基因產(chǎn)物短期表達(dá)、蛋白質(zhì)小規(guī)模表達(dá)純化。
指外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后將外源目的基因整合到宿主染色體中進(jìn)行表達(dá)。
特點(diǎn)：
圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程圖
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法
物理法：電穿孔法、顯微注射法和基因槍法；
化學(xué)法：磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)；
生物法：病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒。
一些轉(zhuǎn)染方法方法的比較
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轉(zhuǎn)染 方法 |
原理 |
應(yīng)用 |
特點(diǎn) |
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電穿孔法 |
高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜點(diǎn)位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 |
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 |
胞用量大，需要根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件 |
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顯微注射法 |
用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 |
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基因槍法 |
將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達(dá) |
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
用于人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞及原代細(xì)胞 |
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磷酸鈣法 |
磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
不適用于原代細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用 |
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陽離子脂質(zhì)體法 |
帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 |
實(shí)用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需要除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 |
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病毒介導(dǎo)法 |
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 |
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等 |
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逆轉(zhuǎn)錄病毒 |
通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。 |
特定宿細(xì)胞 |
攜帶基因不能太大，細(xì)胞需要處于分裂期，需考慮安全因素 |
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腺病毒 |
通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 |
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞 |
可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需要考慮安全因素 |
圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些常見方法
穩(wěn)定細(xì)胞株：一般是將外源DNA克隆到具有某種抗性或者選擇基因的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到染色體中，用載體中所含的選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
1. 基因過表達(dá)、突變、沉默等科研用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建；
2. 重組抗體，細(xì)胞因子等生物藥的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系前期篩選。
1. 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建（1周）
2. 藥物本底濃度測(cè)定（2周，可與1同時(shí)進(jìn)行）
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（1天）
4. 多克隆穩(wěn)定細(xì)胞株篩選及鑒定（2-3周）
5. 單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株篩選及鑒定（3-4周）
6. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株產(chǎn)量、活性檢測(cè)及穩(wěn)定性研究（根據(jù)客戶需求）
圖3 技術(shù)流程圖
高質(zhì)：外源基因嚴(yán)格鑒定，細(xì)胞來源清晰，無污染
高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達(dá)量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達(dá)
穩(wěn)定：獨(dú)有的GS穩(wěn)轉(zhuǎn)系列載體配合MSX藥物篩選，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代15代以上
快速：篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，周期短至3個(gè)月
靈活定制：可針對(duì)重組蛋白/抗體全長(zhǎng)或片段進(jìn)行個(gè)性化表達(dá)
經(jīng)驗(yàn)豐富：專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，已成功為國(guó)內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細(xì)胞株
多篩選系統(tǒng)：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng)，GS/DHFR 篩選孵化系統(tǒng)等
案例
穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)化前表達(dá)量28mg/L；穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)化后表達(dá)量2.3 g/L
