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細(xì)胞轉(zhuǎn)染之穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建

發(fā)表時(shí)間:2023-02-13 訪問次數(shù):523
細(xì)胞轉(zhuǎn)染,簡(jiǎn)而言之,就是將外源分子(如DNA,RNA等)導(dǎo)入真核細(xì)胞中的一種技術(shù)。

分類:

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient gene expression, TGE)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stable gene expression,SGE)兩種。

 
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

指外源 DNA或RNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不整合到宿主染色體中進(jìn)行外源目的基因的表達(dá)。

特點(diǎn):

1.目的基因未整合到染色體上,超螺旋質(zhì)粒DNA有較高的轉(zhuǎn)染效率;

2.轉(zhuǎn)染24h-72h后常需要用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白、β半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè);

3.表達(dá)持續(xù)時(shí)間48-72h,隨細(xì)胞分裂而稀釋直至丟失;

4.用于快速分析:如基因產(chǎn)物短期表達(dá)、蛋白質(zhì)小規(guī)模表達(dá)純化。

 
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

指外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后將外源目的基因整合到宿主染色體中進(jìn)行表達(dá)。

特點(diǎn):

1.目的基因整合到染色體上,需要使用線性DNA(線性DNA雖然比超螺旋狀的DNA轉(zhuǎn)入量低,但整合率高);
2.外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體中大約為1%,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選,才能得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
3.隨宿主細(xì)胞基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯,并被穩(wěn)定遺傳;
4.用于獲得穩(wěn)定表達(dá)的外源基因的單細(xì)胞克隆:如大規(guī)模蛋白質(zhì)的合成,長(zhǎng)期的藥理學(xué)研究遺傳機(jī)制的研究等。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程圖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法

 

物理法:電穿孔法、顯微注射法和基因槍法;

化學(xué)法:磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo);

生物法:病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒。

一些轉(zhuǎn)染方法方法的比較

轉(zhuǎn)染

方法

           原理

   應(yīng)用

         特點(diǎn)

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜點(diǎn)位,DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞

胞用量大,需要根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件

顯微注射法

用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞

基因槍法

將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達(dá)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

用于人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞,淋巴細(xì)胞及原代細(xì)胞

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

不適用于原代細(xì)胞,操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用

陽離子脂質(zhì)體法

帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞

實(shí)用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需要除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大

病毒介導(dǎo)法

通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等

逆轉(zhuǎn)錄病毒

通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞,之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

特定宿細(xì)胞

攜帶基因不能太大,細(xì)胞需要處于分裂期,需考慮安全因素

腺病毒

通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞

可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,需要考慮安全因素

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些常見方法

普健穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
 

穩(wěn)定細(xì)胞株:一般是將外源DNA克隆到具有某種抗性或者選擇基因的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到染色體中,用載體中所含的選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選,篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。

 
服務(wù)內(nèi)容

1. 基因過表達(dá)、突變、沉默等科研用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建;

2. 重組抗體,細(xì)胞因子等生物藥的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系前期篩選。

 
技術(shù)流程及周期

1. 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建(1周)

2. 藥物本底濃度測(cè)定(2周,可與1同時(shí)進(jìn)行)

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1天)

4. 多克隆穩(wěn)定細(xì)胞株篩選及鑒定(2-3周)

5. 單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株篩選及鑒定(3-4周)

6. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株產(chǎn)量、活性檢測(cè)及穩(wěn)定性研究(根據(jù)客戶需求)

圖3 技術(shù)流程圖

 
服務(wù)優(yōu)勢(shì)

高質(zhì):外源基因嚴(yán)格鑒定,細(xì)胞來源清晰,無污染

高產(chǎn):重組蛋白/抗體表達(dá)量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達(dá)

穩(wěn)定:獨(dú)有的GS穩(wěn)轉(zhuǎn)系列載體配合MSX藥物篩選,實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代15代以上

快速:篩選高產(chǎn)細(xì)胞株,周期短至3個(gè)月

靈活定制:可針對(duì)重組蛋白/抗體全長(zhǎng)或片段進(jìn)行個(gè)性化表達(dá)

經(jīng)驗(yàn)豐富:專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì),已成功為國(guó)內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細(xì)胞株

多篩選系統(tǒng):G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng),GS/DHFR 篩選孵化系統(tǒng)等

 

案例

穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)化前表達(dá)量28mg/L;穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)化后表達(dá)量2.3 g/L