CHO細(xì)胞作為細(xì)胞界的高富帥,早在8年前它就已經(jīng)身價(jià)超過了500億美金。大部分成功人士的背后都藏有一部血淚史,它們也不例外。
Long long ago,它們也只是一種名叫中國倉鼠的物種身上默默無聞的卵巢細(xì)胞。
So,diao絲是如何開啟逆襲之路的呢?
讓我們將時(shí)間撥回到1919年,北京協(xié)和醫(yī)院的E.T. Hsieh博士在肺炎球菌感染研究時(shí),一時(shí)找不到實(shí)驗(yàn)室專用小鼠,于是派人去京郊把遍地都是的中國倉鼠逮了不少回來用于實(shí)驗(yàn)。那時(shí)誰也不曾想到就是這么一個(gè)現(xiàn)在看來很神奇的操作,將把中國倉鼠們帶上了一條被馴化成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的“不歸路”。我們也不知道當(dāng)年那群在京郊晃悠的倉鼠們回憶至此會(huì)不會(huì)后悔沒有好好規(guī)劃行動(dòng)路線,嚶嚶嚶......
1924年,又是兩名在協(xié)和工作的研究人員,Jocelyn Smyly和Charles Young發(fā)現(xiàn)中國倉鼠很容易感染寄生蟲利什曼原蟲從而引發(fā)Black fever黑熱病,至此中國倉鼠寶寶們“淪”為科研人員研究各種傳染性疾病的有力工具。
隨著時(shí)間的推移中國倉鼠在醫(yī)學(xué)界的作用有目共睹。1928年,還是協(xié)和醫(yī)學(xué)院,有個(gè)叫Marshall Hertig的研究人員將150只中國倉鼠帶到了哈佛醫(yī)學(xué)院,希望將其建成一個(gè)品系,結(jié)果。。。結(jié)果他沒成功。
一直到了1943年,現(xiàn)代遺傳學(xué)先驅(qū)Guido Pontecorvo(對(duì),就是那個(gè)發(fā)現(xiàn)真菌準(zhǔn)確周期的Ponte)在低倍顯微鏡下觀察中國倉鼠的染色體,發(fā)現(xiàn)只有14條(實(shí)際為2n=22),比起其它常用的實(shí)驗(yàn)鼠(小鼠的40條、大鼠的42條)要少,這使得中國倉鼠又多了一項(xiàng)送命奉獻(xiàn)業(yè)務(wù)--用于染色體的研究。
轉(zhuǎn)眼到了1948年12月,某個(gè)冬日黑暗的深夜,正在中國參加洛克菲勒基金會(huì)研究亞洲瘧疾醫(yī)學(xué)計(jì)劃的Dr.Robert Briggs Watson受美國北部最大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商Victor Schwentker囑托,帶著20只由胡正祥教授贈(zèng)予的中國倉鼠,穿過紛飛的戰(zhàn)火歷經(jīng)千辛萬苦運(yùn)至美國舊金山,最后又轉(zhuǎn)輾轉(zhuǎn)到紐約成功交到Victor Schwentker手中。
大難不死,必有后福,經(jīng)過Victor Schwentker兩年的專門馴養(yǎng),中國倉鼠終于被馴化成一種實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物品系。這其中還有一個(gè)小插曲,哈佛大學(xué)的George Yerganian用更好的顯微鏡發(fā)現(xiàn)中國倉鼠有22條染色體,不是此前Pontecorvo報(bào)道的14條,即便如此小倉鼠們也擁有用于染色體研究的絕對(duì)優(yōu)勢。
Yerganian在長時(shí)間飼養(yǎng)中國倉鼠過程中,針對(duì)其特性摸索出一套專門的飼養(yǎng)方法,并將此套方法公開。不過也許是因?yàn)檫@些小倉鼠們水土不服吃不慣“西餐”,也許是因?yàn)樯鲜鲲曫B(yǎng)方法不一定適用于所有中國倉鼠族群。很長一段時(shí)間內(nèi),Yerganian成為了此品系在美唯一供應(yīng)商,單一供應(yīng)限制中國倉鼠大面積應(yīng)用。
命運(yùn)的齒輪轉(zhuǎn)到1957年,University of Colorado Medical Center的Dr.Theodore T. Puck和其同事Fa-Ten Kao在波士頓癌癥研究中心得到一只雌性中國倉鼠(你們絕對(duì)想不到這只倉鼠是被一名中年婦女放在提籃里,乘坐2天火車抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室的,是不是很妙的操作),并成功分離我們熟知的CHO-K1細(xì)胞系,由于該細(xì)胞快速懸浮生長和高蛋白表達(dá)的特性,CHO細(xì)胞開始在科研和企業(yè)獲得普遍的應(yīng)用。
1983年,Dr.Theodore T. Puck成立Cytogen Research and Development, Inc.公司,無償為研究機(jī)構(gòu)提供中國倉鼠。
1984年,Genentech公司首次實(shí)現(xiàn)重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)并于1987年成功獲批上市,這是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白藥物的一個(gè)標(biāo)志性事件。
隨后,許多外源蛋白基因相繼被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞,一些有價(jià)值的蛋白不斷實(shí)現(xiàn)表達(dá),包括凝血因子(coagulation factors)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、免疫球蛋白(immune globulin)、尿激酶(urokinase)、乙肝表面抗原(HBsAg)和單克隆抗體等,極大地促進(jìn)了生物藥工業(yè)的發(fā)展。
同時(shí),隨著CHO細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室的普及,科學(xué)家成功分離出不同亞型的CHO細(xì)胞株,比如CHO-S, , CHO DXB11, CHO DG44, CHO-M以及近年來受到持續(xù)關(guān)注的GS基因敲除CHO細(xì)胞(如Merck/Sigma Aldrich公司的CHOZN, Lonza的CHO GS Xceed, Horizon公司用rAAV技術(shù)敲除的CHO細(xì)胞)。
在與科研人員多年相愛相殺中,CHO也終于走向“鼠”生巔峰。
目前,中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細(xì)胞,因?yàn)榕c其他系統(tǒng)相比,CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):①CHO 細(xì)胞對(duì)蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能,因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白;②CHO 細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對(duì)較強(qiáng),可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式;③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定,重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá);④表達(dá)的目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,并且CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白,有利于目的蛋白的提取。
至今為止,F(xiàn)DA(美國食品藥品管理局)和EMA(歐洲藥品管理局)已經(jīng)批準(zhǔn)超過70種治療性mAbs,其中39種是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)(見表1),除此之外,還有幾百種mAbs處于臨床階段。
普健生物的XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)
簡介:XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)是Atagenix 基于CHO-K1自主開發(fā)的一套高效表達(dá)蛋白和抗體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)不僅表達(dá)量高(一般為200-400mg/L,部分抗體的表達(dá)量高達(dá)1g/L),而且工藝簡單,既適用人源化抗體小體積高通量篩選,又適用于大體積的放大生產(chǎn)。
重組蛋白在抗原制備、蛋白相互作用、酶學(xué)分析、藥物靶標(biāo)研究等方面應(yīng)用廣泛,選擇合適的重組蛋白表達(dá)方法對(duì)于能否及時(shí)獲得所需數(shù)量和質(zhì)量的重組蛋白至關(guān)重要。常規(guī)的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)我們并不陌生,主要有原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),各有優(yōu)缺點(diǎn),其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)的蛋白更接近天然狀態(tài),且最容易保留生物活性,而備受關(guān)注,但表達(dá)量通常是一大難題。
臨床及實(shí)驗(yàn)室研究中,經(jīng)常要求在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)一定量的重組蛋白。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株生產(chǎn)重組蛋白過程繁瑣且周期長;瞬時(shí)基因表達(dá)技術(shù)則能在短期內(nèi)高表達(dá)重組蛋白,因而得到廣泛應(yīng)用。隨著生物醫(yī)藥研究技術(shù)的發(fā)展,快速生產(chǎn)毫克到克級(jí)別的重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)體系被廣泛用于新藥篩選和臨床前研究。
1 XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)簡介
XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)是Atagenix 自主開發(fā)的一套高效表達(dá)蛋白和抗體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),主要包括以下組分:
① XtenCHOTM cell line;② ATGfect solution;③ Basic expression medium/ATGfeed medium。該系統(tǒng)不僅表達(dá)量高(一般為200-400mg/L,部分抗體的表達(dá)量高達(dá)1g/L),而且工藝簡單,既適用人源化抗體小體積高通量篩選,又適用于大體積的放大生產(chǎn)。
2 XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢
① XtenCHOTM 細(xì)胞是Atagenix 開發(fā)的一種經(jīng)基因改造的重組CHO細(xì)胞株,使用含配套元件的載體,可以使轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的表達(dá)載體拷貝數(shù)增加,延長游離質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的停留時(shí)間,從而使載體攜帶的目的基因獲得高水平,持續(xù)表達(dá)。
② XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)改進(jìn)了CHO常規(guī)轉(zhuǎn)染方法,采用新穎的高密度轉(zhuǎn)染方法和特殊的細(xì)胞培養(yǎng)模式,提高了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活率,使轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活時(shí)間從常規(guī)6-7天延長至10-14天,進(jìn)一步提高了目的蛋白的產(chǎn)量。
③ XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基相較于常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO 瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基以及補(bǔ)料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性價(jià)比高的特點(diǎn)。
3 XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)測試結(jié)果
3.1 與其它商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)的比較
使用XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)和其它公司的兩個(gè)商業(yè)化CHO 瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)CHO Expression system 1 和 CHO Expression system 2 同時(shí)對(duì)一個(gè)抗體進(jìn)行表達(dá),轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度和活率監(jiān)測及抗體產(chǎn)量見圖1和圖2:
圖1 不同表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞密度活率監(jiān)測
圖2 不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)相同抗體產(chǎn)量比較
3.2 不同治療性重組抗體表達(dá)測試
選取4種典型的治療性重組抗體序列,用XtenCHOTM 高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)測試。抗體產(chǎn)量見圖3:
圖3 XtenCHOTM 系統(tǒng)表達(dá)不同抗體的產(chǎn)量測定
Ab1: Pembrolizumad, Ab2: Utomilumab, Ab3: PF, Ab4: Claudiximab
普健生物正是應(yīng)用自有的高密度重組抗體表達(dá)系統(tǒng)XtenCHOTM實(shí)現(xiàn)全長及多種形式的重組抗體表達(dá),利用自主開發(fā)細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可實(shí)現(xiàn)重組抗體的克級(jí)生產(chǎn)。同時(shí)擁有內(nèi)毒素控制和去除的專一主線,能夠達(dá)到制藥級(jí)別的內(nèi)毒控制(<0.1EU/mg),可提供一系列高質(zhì)量藥物對(duì)照抗體,供科研工作者選購使用。
Specificity Target |
Name |
Catalog |
Species |
identification |
Source |
IL-6R |
Tocilizumab ( 托珠單抗 ) |
ATAD00661 |
Humanized |
IgG1 |
CHO cells |
ANGPTL3 |
Evinacumab ( 依維蘇單抗 ) |
ATAD00368 |
Homo sapiens |
IgG4-kappa |
CHO cells |
C5 |
Eculizumab ( 依庫珠單抗 ) |
ATAD00006 |
Humanized |
IgG2-G4-kappa |
CHO cells |
C5 |
Ravulizumab ( 雷夫利珠單抗 ) |
ATAD00472 |
Humanized |
IgG2-G4-kappa |
CHO cells |
CALCA /CALCB |
Eptinezumab ( 依普奈珠單抗 ) |
ATAD00452 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
CD19 |
Tafasitamab |
ATAD00363 |
Humanized |
IgG1-G2-kappa |
CHO cells |
CD19 |
Inebilizumab ( 英比利珠單抗 ) |
ATAD00387 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
CD22 |
Inotuzumab ( 奧英妥珠單抗 ) |
ATAD00166 |
Humanized |
IgG4-kappa |
CHO cells |
CD3 |
Teplizumab ( 替利組單抗 ) |
ATAD00665 |
Humanized |
CHO cells |
|
CD3E |
Otelixizumab ( 奧昔組單抗 ) |
ATAD00147 |
Chimeric,Humanized |
IgG1-lambda |
CHO cells |
CD52 |
Alemtuzumab ( 阿侖珠單抗 ) |
ATAD00001 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
CTLA4/CD152 |
Tremelimumab ( 曲美木單抗 ) |
ATAD00156 |
Homo sapiens |
IgG2-kappa |
CHO cells |
EGFR/ERBB1 |
Necitumumab ( 奈妥木單抗 ) |
ATAD00193 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
ERBB2 |
Trastuzumab ( 曲妥珠單抗 ) |
ATAD00686 |
Humanized |
Human IgG1 |
CHO cells |
ERBB2/EGFR2/CD340 |
Pertuzumab ( 珀妥珠單抗 ) |
ATAD00025 |
Humanized |
IgG1-kappa |
CHO cells |
IGF1R/CD221 |
Ganitumab ( 加尼妥單抗 ) |
ATAD00096 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
IGHE |
Tanezumab ( 他尼組單抗 ) |
ATAD00142 |
Humanized |
IgG1-nd |
CHO cells |
IL12B |
Ustekinumab ( 烏司奴單抗 ) |
ATAD00100 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
IL17A |
Secukinumab ( 司庫奴單抗 ) |
ATAD00222 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
IL1B |
Canakinumab ( 卡那奴單抗 ) |
ATAD00155 |
Homo sapiens |
IgG1-kappa |
CHO cells |
參考資料:
Rawley JD.Theodore T. Puck (September 24, 1916–November 6, 2005). American Journal HumanGenetics 2006;78(3): 365–366.
Kim JY et al. CHO cells inbiotechnology for production of recombinant proteins: current state and furtherpotential. Applied Microbiology and Biotechnology 2012;93(3): 917–930.
Urlaub G; Chasin LA. Isolation of Chinesehamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity[J].Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 1980-07, 77 (7):4216-4220.
Landauer K, Woischnigg H, Hepp N et al (2011)Development of a chemically defined CHO medium by engineering based on a feed solution.BMC Proc 5(Suppl 8):P41
CHO MEDIA PLATFORM FACILITATES INTEGRATED CELLLINE DEVELOPMENT AND MEDIA OPTIMIZATION, IrvineScientic Poster in ESACT 2017