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利用Single B方法快速制備高效BSA抗體對的策略

發(fā)表時間：2023-06-21 訪問次數(shù)：521
研究背景

殘余牛血清白蛋白（BSA）含量檢測是生物制品質(zhì)量控制的一項重要指標，直接關系到生物制品的使用安全。世界衛(wèi)生組織及世界各國藥典對殘余BSA含量均有嚴格限定。《中國藥典》（三部）2020版規(guī)定，成品中牛血清白蛋白殘留量不得>50ng/劑。因此，需要利用特異性好，靈敏度高的抗體建立一種簡便、高效的牛血清白蛋白殘留量檢測方法。

 
客戶痛點

牛血清廣泛使用于生物制品研究、制備過程中，雖然在生產(chǎn)過程中經(jīng)純化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制劑成品中。在人體中，超過一定濃度的BSA易引起人的免疫病理反應，引起嚴重的副作用，影響生物制品的安全性。普健生物基于客戶需求，對BSA有更為嚴苛的控制標準，此前我們基于鼠抗開發(fā)平臺開發(fā)出靈敏度為0.51ng/ml，可檢測1.56-100ng/mL的BSA檢測試劑盒。能滿足現(xiàn)行藥典規(guī)范BSA殘留檢測要求，并有了穩(wěn)定的客戶群體。但在后續(xù)的產(chǎn)品回訪中，我們的項目經(jīng)理進一步了解了客戶的項目對BSA殘留其實有更為嚴苛的控制標準，只是苦于市售產(chǎn)品檢測限以及靈敏度未能完全滿足。普健生物技術(shù)團隊深挖客戶需求，結(jié)合普健生物最新推出的XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)，為客戶提供了一種全新、高效、高靈敏度的BSA檢測解決方案。

 
普健全新解決方案
 

本公司利用兔單B細胞抗體開發(fā)技術(shù)，從BSA免疫的兔外周血中，分離BSA特異性的單B細胞，通過PCR 擴增及測序分析， 獲得多個特異性識別BSA蛋白的抗體。

本方案篩選的兔單抗較傳統(tǒng)方法雜交瘤技術(shù)篩選的抗體及兔多抗的親和力和特異性更高，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強的特點，檢測范圍為0.78-50ng/mL，為開發(fā)高靈敏度的BSA殘留檢測試劑盒奠定了堅實的基礎。

圖1 普健生物XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)流程

 

01
動物免疫及單B細胞分選
 

利用普健生物開發(fā)的快速免疫方法免疫新西蘭大白兔，三免（Day21）血清效價大于128K，可以進行后續(xù)單B細胞流式分選。然后將從PBMC中分離篩選到的B細胞進行抗原特異性檢測，陽性率大于60%。

抗原

BSA

包被

1ug/ml*100ul
 

2k

4k

8k

16k

32k

64k

128k

PBS

效價

三免血清效價

4.32

3.32

3.26

2.98

2.53

1.85

1.16

0.03

>128K

圖2 BSA兔血清三免（Day21）效價檢測結(jié)果

圖3 單B細胞ELISA檢測部分結(jié)果展示

 
02
陽性抗體測序及序列分析
 

根據(jù)單B細胞ELISA檢測結(jié)果，挑選12個克隆進行抗體基因測序及分析，12個克隆測序全部成功。

 

圖4 抗體可變區(qū)基因分析結(jié)果

 
03
重組兔抗表達及鑒定
 

將測序得到的12個抗體挑選10個，利用普健生物自主開發(fā)的XtenCHO系統(tǒng)進行重組表達，純化后得到純度高，親和力好的重組兔單抗。10株重組兔單抗ELISA效價均大于1:1000000。

圖5 重組兔抗SDS-PAGE檢測結(jié)果

 

圖6 純化后重組兔抗ELISA檢測結(jié)果

 
 
04
BSA抗體對開發(fā)
 

將10株重組兔單抗進行方陣實驗配對，得到多對靈敏度高的抗體對，優(yōu)選其中一對, 標曲線性范圍0.78-50ng/mL, R2=0.9992。

圖7 BSA抗體對標準曲線

 
05
抗BSA鼠單抗和兔單抗親和力比較
 

為了了解不同方法制備抗體親和力的差異，我們將BSA的兔單抗與之前自產(chǎn)的用傳統(tǒng)雜交瘤制備的BSA鼠單抗進行了親和力的測試。在此，我們利用OPENSPR將鼠單抗、兔單抗和BSA進行了親和力檢測，發(fā)現(xiàn)兔單抗的親和力比鼠單抗高1-2個數(shù)量級。

  ka(1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BSA&兔抗3D5

2.21E+05

1.90E-05

8.61E-11
BSA&兔抗6B7 1.39E+05 7.49E-06 5.38E-11
BSA&鼠抗1 2.81E+04 1.39E-04 4.95E-09
BSA&鼠抗2 1.48E+05 2.02E-05 1.36E-10

剩余未分選的B細胞以及篩選陽性的其他單B細胞可以凍存，以便用于后續(xù)篩選其他應用需求的抗體。

聯(lián)系我們

如果您對我們的單克隆抗體開發(fā)技術(shù)服務感興趣,您可以直接點擊閱讀原文或點擊文字鏈接，實時與我們項目經(jīng)理溝通！服務咨詢電話：027-87001869

 

普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作為武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務平臺—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務平臺。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術(shù)平臺的建設和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過10年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務覆蓋全國、輻射全球的高新技術(shù)服務企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實驗室（包含800平高標準BSL-2級細胞房），擁有齊全蛋白抗體開發(fā)設備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent 流式細胞分析儀，全自動HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測定儀，Olympus熒光顯微鏡，BTX電融合儀，2*7L微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機，全自動管式化學發(fā)光儀，以及配套的高速離心機，細胞計數(shù)儀及大容量細胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽：3551人才計劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進型服務企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)
 
 

普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達系統(tǒng)，Single B細胞抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)平臺，噬菌體展示抗體庫技術(shù)和雜交瘤抗體開發(fā)平臺，抗體表達、抗體人源化和穩(wěn)定細胞株構(gòu)建平臺，與各研究機構(gòu)展開技術(shù)服務項目合作，助力IVD檢測、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開發(fā)。

普健生物一站式抗體發(fā)現(xiàn)平臺，專注于活性蛋白，功能性抗體開發(fā)。

 

武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務平臺

一站式抗體發(fā)現(xiàn)整體解決方案

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