人口密度、旅行頻率和免疫受損個(gè)體數(shù)量的增長(zhǎng)增加了病原體致病的機(jī)會(huì)。重組抗體技術(shù)可以幫助確定病原體的免疫逃逸機(jī)制，并通過(guò)識(shí)別功能相關(guān)的抗體靶點(diǎn)、改造抗體使抗體逃逸策略無(wú)效以及捕獲隱藏在宿主細(xì)胞內(nèi)的病原體來(lái)對(duì)抗病原體的免疫逃逸機(jī)制。

結(jié)合保守和可及靶點(diǎn)的抗體通常需要宿主免疫應(yīng)答來(lái)預(yù)防或化解感染。在這些情況下，調(diào)理過(guò)的病原體可通過(guò)多種機(jī)制被破壞，包括補(bǔ)體溶解、吞噬作用或NK介導(dǎo)的對(duì)受感染細(xì)胞的殺傷。例如，簡(jiǎn)單地用抗體標(biāo)記病原體，通過(guò)Fc受體而不是自然入侵途徑介導(dǎo)吞噬作用，就可以將病原體送到溶酶體進(jìn)行破壞。作為應(yīng)答，細(xì)菌和病毒病原體進(jìn)化出了逃避這些保護(hù)性免疫功能的策略，包括破壞補(bǔ)體級(jí)聯(lián)或削弱宿主免疫細(xì)胞捕獲和破壞內(nèi)化病原體能力的蛋白質(zhì)。阻斷免疫逃逸蛋白的抗體可以恢復(fù)免疫功能，而工程抗體可以靶向隱蔽的細(xì)胞壁龕中的細(xì)菌。

保護(hù)補(bǔ)體活性的抗體
經(jīng)典補(bǔ)體途徑被大量表面抗原激活，這些表面抗原使IgG抗體能夠結(jié)合和六聚化，或者更有效地與天然五聚體或六聚體IgM分子結(jié)合(Figure 4)。這些抗體隨后可與C1q蛋白的6個(gè)球狀頭結(jié)合，從而激活蛋白水解級(jí)聯(lián)。由此導(dǎo)致的C3b沉積在病原體表面，通過(guò)與白細(xì)胞上的補(bǔ)體受體(尤其是補(bǔ)體受體3)結(jié)合介導(dǎo)吞噬作用。如果C3b密度高，則可形成裂解膜攻擊復(fù)合物來(lái)裂解革蘭陰性菌和病毒粒子。因?yàn)椴皇撬械目乖荚诳臻g上排列以支持IgG六聚體的有效形成，殘基的變化(E430G和E345K或-R)被確定為獨(dú)立增加Fc-Fc相互作用支持六聚體的形成，導(dǎo)致C1q結(jié)合增加和5 - 7倍的補(bǔ)體激活。當(dāng)與靶向保守淋病奈瑟菌脂寡糖表位的抗體結(jié)合時(shí)，與未修飾的Fc相比，這些經(jīng)過(guò)改造的HexaBody Fc結(jié)構(gòu)域通過(guò)僅需要補(bǔ)體激活的機(jī)制介導(dǎo)了小鼠體內(nèi)細(xì)菌清除的增強(qiáng)。

補(bǔ)體逃避策略在細(xì)菌病原體中常見(jiàn)，包括產(chǎn)生膠囊以保護(hù)抗體接觸到抗原、招募補(bǔ)體抑制劑的表面抗原和切割補(bǔ)體蛋白的蛋白酶(Figure 4)。靶向這些抗原的抗體可同時(shí)阻斷抑制劑與抑制劑的結(jié)合，并將C1q招募到病原體表面，從而起到殺滅細(xì)菌的作用。與奈瑟氏菌結(jié)合的抗體最有力地證明了這一點(diǎn)，奈瑟氏菌是細(xì)菌性腦膜炎和膿毒癥的一個(gè)重要原因，經(jīng)典補(bǔ)體途徑在殺菌作用中占主導(dǎo)地位。
然而，fHBP被推測(cè)在血清中與fH形成復(fù)合物，這將限制保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，而保護(hù)性抗體可競(jìng)爭(zhēng)性抑制fH/fHBP的相互作用。為了解決這一問(wèn)題，研究人員利用重組技術(shù)開(kāi)發(fā)了fH免疫原，改良后的fHBP免疫恒河猴后，血清IgG滴度比原fHBP提高3倍，血清殺菌滴度比原fHBP提高150倍，這與補(bǔ)體成分C4b在活菌上沉積增加有關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示，靶向其他生物體表達(dá)的逃避補(bǔ)體的抗原可能支持疫苗研發(fā)工作。

Figure 4  Microbial disruption of the classical complement cascade by recruiting inhibitors or degrading complement proteins. Key steps of the classical pathway of antibody activation are shown: ① The complement proteins C1q and then C1r and C1s bind hexamerized IgG or IgM on the pathogen surface to form the C1 complex. ② Complement components C2 and C4 are cleaved to produce membrane-bound C4b and C2a, which form the C3 convertase. ③ This cleaves C3 to release C3a and deposit C3b covalently on the membrane. ④ When C3b levels are high, it joins the C3 convertase to form the C5 convertase, which cleaves C5 to release C5a and deposit C5b on the membrane. ⑤ Components C6–C9 join C5b to form the membrane attack complex and osmotically lyse the target membrane. Released C3a and C5a are chemoattractants for leukocytes, while membrane-bound C3b can engage complement receptors such as CR3 to trigger phagocytosis. The lectin pathway follows a similar cascade but is initiated by the mannose-binding lectin complex, which recruits C1q; the alternate pathway results from spontaneous C3 cleavage and C3b deposition to enter at the C3 convertase step using an alternate C3b/Bb complex. Many of these steps can be inhibited by pathogen components, including proteins that bind or cleave Fc to inhibit C1q recruitment (e.g., protein A and staphylokinase), proteins that recruit host complement regulators (e.g., the Neisseria fHBP, which recruits fH, and Bordetella pertussis Vag8, which recruits C1 inhibitor), and enzymes that degrade complement components (e.g., staphylokinase depletes C3). Engineering efforts to overcome these strategies include the use of HexaBodies, which favor C1q binding; antibodies resistant to capture by Fc-binding proteins or cleavage by bacterial proteases; and antibodies that block recruitment of complement inhibitors such as factor H. Abbreviations: fH, factor H; fHBP, factor H binding protein. Adapted from images created with BioRender.
保護(hù)白細(xì)胞功能的抗體
許多細(xì)菌產(chǎn)生白細(xì)胞毒素，而白細(xì)胞毒素會(huì)損害免疫細(xì)胞捕獲和摧毀病原體的能力。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生一系列具有冗余互補(bǔ)功能的殺白細(xì)胞素，包括α-溶血素(Hla)和5種雙組分細(xì)胞毒素HlgAB、HlgCB、LukSF、LukED和LukGH。
一旦調(diào)理抗體結(jié)合病原體表面的保守表位，白細(xì)胞毒素的分泌可能會(huì)限制吞噬之前或之后的細(xì)菌殺滅。在這種情況下，阻斷白細(xì)胞毒素活性的抗體有望與調(diào)理抗體產(chǎn)生協(xié)同作用。Tkaczyk等表明，在金黃色葡萄球菌感染的致死性肺炎和菌血癥模型中，與調(diào)理抗體結(jié)合的ClfA與中和抗體的Hla有協(xié)同作用。

靶向內(nèi)化細(xì)菌的抗體-抗生素偶聯(lián)物
雖然傳統(tǒng)上認(rèn)為胞內(nèi)細(xì)菌具有專性或兼性胞內(nèi)生活方式，但越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到，被吞噬的細(xì)菌可以作為活生物體的儲(chǔ)存庫(kù)，以種子感染。例如，金黃色葡萄球菌很容易被巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬。雖然大多數(shù)內(nèi)化的細(xì)菌被殺死，但有一部分抵抗殺死，并利用吞噬細(xì)胞介導(dǎo)擴(kuò)散到其他部位。對(duì)于金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)存活幫助細(xì)菌逃避固有免疫防御，并通過(guò)程序性壞死破壞中性粒細(xì)胞，殺白細(xì)胞素通過(guò)誘導(dǎo)程序性壞死介導(dǎo)細(xì)菌生存/逃逸。此外，許多病毒在低PH核內(nèi)體中進(jìn)行進(jìn)入宿主細(xì)胞所需的膜融合事件(例如流感和埃博拉病毒)。在這兩種情況下，免疫系統(tǒng)、抗體和抗生素基本上無(wú)法接觸到細(xì)胞內(nèi)的病原體。巧妙的工程策略可以向這些細(xì)胞內(nèi)生物遞送多功能抗體，從而支持通過(guò)天然免疫細(xì)胞功能或聯(lián)合遞送抗生素來(lái)破壞病原體。

調(diào)理抗體已被設(shè)計(jì)用于將抗生素或其他抗毒分子與細(xì)胞內(nèi)病原體共定位。多功能抗體-抗生素偶聯(lián)物依賴于與豐富的細(xì)菌表面抗原結(jié)合的抗體成分，將其標(biāo)記為吞噬入核內(nèi)體，核內(nèi)體可能含有之前內(nèi)化的細(xì)菌（Figure 5a）。在體外，抗體-抗生素偶聯(lián)物殺死了巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)化的細(xì)菌。

Figure 5  Antibodies that target intracellular pathogens. (a) Antibody–antibiotic conjugates bind bacterial surface antigens and are internalized with the bacteria by natural or phagocytic mechanisms. Once internalized, the antibiotic is released by resident enzymes to kill co-localized bacteria. (b) Bispecific antibody MEDI3902 uses one binding site to bind the Psl surface antigen on Pseudomonas aeruginosa and mediate phagocytosis. After translocation to the endosome, the second antibody-binding site blocks type III secretion to support endosome acidification and bacterial killing. (c) The mannose-6-phosphate receptor can mediate antibody transfer to an endolysosome that may already contain Ebola virions. Once co-localized, the antibody can block Ebola–receptor interactions to prevent viral escape into the cellular cytosol. Adapted from images created with BioRender.
這一策略耗盡了不易接近的細(xì)菌儲(chǔ)存庫(kù)，否則這些儲(chǔ)存庫(kù)將成為反復(fù)感染的來(lái)源。雖然殺菌活性是新型抗生素的關(guān)鍵要求，但這些分子通常也具有不良的宿主毒性。與抗體結(jié)合的益處是降低治療劑量，同時(shí)延長(zhǎng)循環(huán)半衰期，并在釋放前將抗生素定位到感染部位。
這種策略可以減少全身毒性，同時(shí)在吞噬體內(nèi)達(dá)到殺滅細(xì)菌所需的高局部抗生素濃度。它可能也適用于專性病原體，例如伯克霍爾德菌屬。

用于獲取內(nèi)化病原體的雙特異性抗體
雙特異性抗體使用類似的方法，其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記病原體，使其被吞噬，而另一個(gè)發(fā)揮互補(bǔ)功能，如阻斷使細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)適合病原體的毒力因子。這類藥物中最先進(jìn)的方法是MEDI3902，該藥物最近完成了Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT02696902)。雙特異性抗體的產(chǎn)生是通過(guò)一組阻斷核內(nèi)體pH的受體結(jié)合位點(diǎn)，而另一組通過(guò)結(jié)合病毒粒子上保守的非中和表位來(lái)介導(dǎo)吞噬和核內(nèi)體遞送。這一概念可以擴(kuò)展到阻斷其他蛋白質(zhì)的功能，這些蛋白質(zhì)支持病原體逃逸或維持內(nèi)體作為病原體的適宜環(huán)境，例如金黃色葡萄球菌白細(xì)胞毒素。

上述策略需要抗體和病原體在內(nèi)化之前相互作用，這可能為治療已確立的感染或清除所有細(xì)胞內(nèi)病原體帶來(lái)挑戰(zhàn)。作為替代方案，抗體可以單獨(dú)遞送，與已經(jīng)存在于核內(nèi)體或溶酶體中的病原體結(jié)合。這可以通過(guò)胞飲作用和FcRn介導(dǎo)的抗體跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生；在這一過(guò)程中，含有抗體的內(nèi)體可以與含有流感病毒顆粒的內(nèi)體融合，從而中和血凝素，防止流感病毒與宿主細(xì)胞膜融合。

這里描述了三種互補(bǔ)的策略來(lái)靶向隱藏在細(xì)胞內(nèi)的病原體?？贵w可阻斷阻止宿主細(xì)胞殺死內(nèi)化細(xì)菌的細(xì)胞毒素活性，或者可介導(dǎo)將抗生素和細(xì)菌靶向遞送至吞噬體，從而殺滅細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在這兩種情況下，確定細(xì)菌表面抗原作為抗體靶點(diǎn)，并在吞噬之前將抗體與病原體結(jié)合對(duì)于成功進(jìn)行吞噬至關(guān)重要。較新的方法將保護(hù)性抗體靶向遞送到已經(jīng)含有病原體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，可能對(duì)于已發(fā)生的感染有優(yōu)勢(shì)。

任何新的策略都可能施加選擇壓力，促使性狀發(fā)生改變的生物體出現(xiàn)。然而，許多病原體的持續(xù)存在以及新病原體的出現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了預(yù)防和改善感染的創(chuàng)新方法的必要性。