概述(Summary)icon

產(chǎn)品貨號

ATO00034

產(chǎn)品描述(Description)

包涵體是指超表達(dá)的蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)或膜間內(nèi)凝集形成的無活性的固體顆粒。包涵體形成的主要原因在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白折疊輔助因子，或環(huán)境不適導(dǎo)致無法形成正確的蛋白次級鍵。由于包涵體主要由超表達(dá)的重組蛋白質(zhì)組成，因此分離純化包涵體是分離純化具有活性的重組蛋白的第一步。本公司生產(chǎn)的包涵體純化試劑盒用于快速純化包涵體得到可溶蛋白，無需繁瑣變復(fù)性即可用于后續(xù)實(shí)驗。

儲存條件(Storage)

常溫保存，保質(zhì)期一年。

Note

For research use only .

使用方法(Standard Operating Procedure)icon

1.收集包涵體

(1)離心收集培養(yǎng)好的菌液。

(2)加入10ml(建議體積為1/20的菌體培養(yǎng)體積)的Buffer P1懸浮菌液(建議一次處理200ml菌液)。

(3)冰浴下超聲，破菌 8s，間隔 8s，80 次(頻率 200Hz 以上).

注意：此步驟需低溫，快速。

(4)立刻加入蛋白酶抑制劑PMSF等。

(5)4℃，10000g離心10min，收集包涵體。

2.包涵體純化

2.1蛋白包涵體表達(dá)量高時，可按以下步驟快速獲得大量可溶的重組蛋白

注：使用前請將10 × Buffer P2母液按照1:10稀釋成工作液，再進(jìn)行如下操作：

(1)包涵體用10ml的Buffer P2重懸。

(2)4℃，10000g離心10min，收集包涵體。

(3)重復(fù)以上兩步操作 3-6次。(該步驟建議段時超聲處理離心后結(jié)塊的包涵體，充分洗滌，能有效提高最終包涵體純度)

(4)棄上清，倒扣吸干殘液。

(5)加入2ml的P3 充分溶解包涵體(根據(jù)包涵體的量可適當(dāng)調(diào)整dP3使用體積)，如有部分不溶解，超聲處理或者適當(dāng)提高P3用量。

(6)4 ℃，10000g離心10min，收集上清。

(7)更換終Buffer進(jìn)行透析。(需自備，建議為TBS Buffer，pH 8.0)

(8)4℃，10000g離心10min，收集上清，即為所需蛋白。(如果蛋白出現(xiàn)大量沉淀，透析前終Buffer中加入1%體積的Buffer P5可有效減少蛋白損失)

2.2蛋白包涵體表達(dá)量低時，按以下步驟獲得純度較好的可溶的重組蛋白(以Ni柱親和純化為例)

(1)加入2ml的P3 充分溶解包涵體(根據(jù)包涵體的量可適當(dāng)調(diào)整dP3使用體積)，如有部分不溶解，超聲處理或者適當(dāng)提高P3用量，然后加入等體積ddH2O。

(2)4℃，10000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至干凈的小管中。

(3)后續(xù)純化過程同可溶蛋白純化步驟。用Ni填料吸附蛋白，洗滌Buffer洗去雜蛋白，洗脫Buffer獲得目的蛋白。洗滌Buffer和洗脫Bufferr中均添加1/10體積Buffer P4 有助于提高可溶蛋白得率。

(4)更換終Buffer進(jìn)行透析。(需自備，建議為TBS Buffer，pH 8.0)

(5)4℃，10000g離心10min，收集上清，即為所需蛋白。(如果蛋白出現(xiàn)大量沉淀，透析前終Buffer中加入1%體積的Buffer P5可有效減少蛋白損失)

組分&說明(Component & Instruction)icon