納米抗體如何實(shí)現(xiàn)如此高的特異性？

免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大功能在很大程度上取決于抗原的多樣性，這種多樣性促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的、緊密結(jié)合的抗原受體（BCR）。生物學(xué)研究的重要工具——傳統(tǒng)抗體（Abs）以其精湛的結(jié)合特異性和對靶抗原的高親和力，成為了生物制藥行業(yè)的基礎(chǔ)。然而，這些抗體的結(jié)合特異性的巨大多樣性是由重鏈（VH）和輕鏈（VL）兩個(gè)可變域中的序列變異產(chǎn)生的，如此一來，僅僅這些序列的排列組合就可能在人類中產(chǎn)生至少10種可能的BCR，其數(shù)量遠(yuǎn)超個(gè)體B淋巴細(xì)胞群體的規(guī)模。這個(gè)巨大的潛在序列多樣性是如何轉(zhuǎn)化為抗原特異性的呢？這個(gè)問題目前尚未完全明朗。顯然，存在一定的冗余——并非每個(gè)獨(dú)一無二的VH-VL組合都會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的結(jié)合特異性。然而，想要知道改變結(jié)合特異性所需的氨基酸突變數(shù)量及其位置，目前我們還無法準(zhǔn)確預(yù)測。

在駱駝、美洲駝和羊駝等駱駝科物種中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一類特殊的重鏈抗體，它們可能為我們提供了一個(gè)更易于研究的系統(tǒng)，因?yàn)檫@些抗體中完全沒有輕鏈的存在。其中，被稱為納米抗體的可變VHH結(jié)構(gòu)域（約為傳統(tǒng)抗體的1/10大小），展現(xiàn)出了相當(dāng)高的穩(wěn)定性，并且能夠結(jié)合酶活性位點(diǎn)，病毒衣殼以及G蛋白偶聯(lián)受體中難以接近的表位。駱駝的VHH結(jié)構(gòu)域與Ab的VH結(jié)構(gòu)域在功能上同源，都包含三個(gè)高度可變的環(huán)H1、H2和H3。這三個(gè)環(huán)在折疊蛋白結(jié)構(gòu)域的一側(cè)形成了擴(kuò)展的結(jié)構(gòu)界面，為抗原結(jié)合界面或旁位提供了空間，從而決定了Nb的抗原結(jié)合特異性。相較于六個(gè)在抗體 VH-VL結(jié)構(gòu)域復(fù)合物中高度可變的環(huán)，這三個(gè)環(huán)的潛在序列多樣性明顯更小，這也使得駱駝的VHH結(jié)構(gòu)域在與抗原結(jié)合時(shí)的特異性更易于掌握和控制。

傳統(tǒng)和駱駝形重鏈Abs的結(jié)構(gòu)特征

對于納米抗體（nanobody，Nb）和傳統(tǒng)抗體（Abs）來說，最大的挑戰(zhàn)在于解析出將氨基酸序列（特別是副位殘基的挑選）與折疊分子的結(jié)合特異性相關(guān)聯(lián)的分子密碼。在常規(guī)的抗體中，副位通常會(huì)出現(xiàn)在VH和VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合處，通常會(huì)涉及到多達(dá)六個(gè)不同的高變環(huán)區(qū)域的殘基。此外，VH和VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合方式也有很大的靈活性，使得抗體能夠盡可能地增加潛在抗原結(jié)合表位的多樣性。相比之下，納米抗體（nanobody，Nb）的副位則完全包裹在VHH結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，這樣便大大限制了潛在抗原結(jié)合表位的空間多樣性，而不過多地影響其結(jié)合特異性的多樣性。實(shí)際上，納米抗體（nanobody，Nb）通常會(huì)與其靶抗原緊密結(jié)合，其親和力也與典型單克隆抗體相仿。盡管納米抗體（nanobody，Nb）體積小巧且結(jié)構(gòu)單一，但是它們是如何實(shí)現(xiàn)如此多樣化的結(jié)合特異性的呢？

為了解決這個(gè)問題，研究人員建立了兩個(gè)共晶蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集，每個(gè)數(shù)據(jù)集都包含納米抗體（nanobody，Nb）抗原或傳統(tǒng)抗體（Ab）抗原蛋白復(fù)合物。數(shù)據(jù)集由90個(gè)非冗余蛋白質(zhì)結(jié)合納米抗體（nanobody，Nb）組成，PDB中具有納米抗體（nanobody，Nb）抗原共晶體結(jié)構(gòu)。

Nb結(jié)構(gòu)多樣性與Ab結(jié)構(gòu)多樣性的比較

為了量化納米抗體（nanobody，Nb）VHH結(jié)構(gòu)域和傳統(tǒng)抗體（Ab） VH結(jié)構(gòu)域不同部分的結(jié)構(gòu)變異性，研究人員對抗原接觸殘基的結(jié)構(gòu)比對與鑒定；確定了納米抗體（nanobody，Nb）抗原和傳統(tǒng)抗體（Ab）抗原復(fù)合物的90種共晶體結(jié)構(gòu)，分析了抗原結(jié)合構(gòu)象中的納米抗體（nanobody，Nb）和傳統(tǒng)抗體（Ab）結(jié)構(gòu)變化。

通過對納米序列的研究分析發(fā)現(xiàn)，米抗體（nanobody，Nb）在其框架區(qū)域的序列和結(jié)構(gòu)上更加保守，這表明米抗體（nanobody，Nb）沒有很大程度地利用框架來增加可以編碼的結(jié)合特異性的數(shù)量。那么，為何納米抗體（nanobody，Nb）的序列長度縮短且單域結(jié)構(gòu)緊湊，但依然產(chǎn)生如此多樣化的結(jié)合特異性呢？

傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)中六個(gè)超變量環(huán)是確定Ab相互作用特異性的關(guān)鍵；相比之下，納米抗體（nanobody，Nb）只有三個(gè)高變環(huán)，減少了可能的序列變異的空間，從而減少了潛在的相互作用特異性。因此，研究人員提出了三種潛在機(jī)制。

第一種機(jī)制與納米抗體（nanobody，Nb） H1和H2環(huán)所表現(xiàn)出的顯著增加的結(jié)構(gòu)多樣性有關(guān)。這些環(huán)并不比傳統(tǒng)抗體（Ab）環(huán)表現(xiàn)出更大的序列變異，但結(jié)構(gòu)分析表明，它們確實(shí)表現(xiàn)出更大的結(jié)構(gòu)變異。與傳統(tǒng)抗體（Ab）相比，這種結(jié)構(gòu)多樣性可能是由于不同的環(huán)序列特征——例如，較少的納米抗體（nanobody，Nb）H1環(huán)含有穩(wěn)定的F29，而納米抗體（nanobody，Nb） H2環(huán)使用更大比例的小殘基，這增加了結(jié)構(gòu)的靈活性。無論納米抗體（nanobody，Nb）如何取樣更多種類的環(huán)主鏈構(gòu)象，事實(shí)是它們對實(shí)現(xiàn)高特異性抗原結(jié)合的能力做出了重要貢獻(xiàn)。

其次，根據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，納米抗體（nanobody，Nb）編碼的每個(gè)氨基酸殘基的序列多樣性比傳統(tǒng)抗體（Ab） H3環(huán)多7%左右。更長的H3環(huán)被認(rèn)為能夠使Nbs通過延伸到表位腔內(nèi)的手指狀突起與抗原結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)表明，納米抗體（nanobody，Nb）利用其H3環(huán)中增加的多樣性，使它們能夠產(chǎn)生與它們受到挑戰(zhàn)的抗原緊密特異性結(jié)合的能力。

研究人員基于共晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提出第三種機(jī)制，從比VH結(jié)構(gòu)域更大的范圍內(nèi)繪制旁位殘基的能力將促進(jìn)抗原結(jié)合界面的形狀和物理性質(zhì)的多樣性，使納米抗體（nanobody，Nb）能夠使用更廣泛的表面，通過不同的結(jié)合模式與同源抗原相互作用。

總之，納米抗體（nanobody，Nb）似乎并沒有通過增加框架中的序列或結(jié)構(gòu)多樣性來產(chǎn)生特異性的多樣性。這表明在小蛋白區(qū)域的分子特異性能力比我們基于經(jīng)典抗體的預(yù)期要高得多，這表明使用相對受限的短氨基酸序列與多種靶標(biāo)產(chǎn)生高親和力特異性結(jié)合的潛力令人興奮。

參考文獻(xiàn)：

Laura S. Mitchell, Lucy J. Colwell,Comparative analysis of nanobody sequence and structure data,PROTEINS:Structure, Function, and Bioinformatics,Volume86, Issue7,July 2018,Pages 697-706