單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，其在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究、疾病診斷、藥效學(xué)及臨床應(yīng)用等方面有著不可或缺的作用。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)開始興起，并逐漸得到廣泛應(yīng)用。單個B細(xì)胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體所具有的全人源性、自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景。

Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開發(fā)以單個B細(xì)胞為起始點(diǎn)，利用每個B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從免疫的兔子中通過隨機(jī)分離和抗原特異性分離兩種方式從外周血或淋巴組織中分離單B細(xì)胞，從單個B細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因，進(jìn)而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區(qū)的天然配對，應(yīng)用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。特別是在快速應(yīng)對病原微生物傳染病的抗體開發(fā)上有著巨大優(yōu)勢。基于單個B細(xì)胞技術(shù)的Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開發(fā)有三個主要流程，鑒定和分離單個B細(xì)胞；擴(kuò)增和克隆抗體基因；表達(dá)、篩選和鑒定抗原特異性抗體。

鑒定和分離單個B細(xì)胞
目前普遍運(yùn)用于抗原特異性單個B細(xì)胞分離的方法包括：熒光標(biāo)記抗原多參數(shù)細(xì)胞分選法
(Fluorochrome-labeledantigensviamultiparameter，FACS)、抗原標(biāo)記磁珠分選法(Antigencoatedmagneticbeads)、微雕法(Microengraving)以及細(xì)胞微陣列芯片法(Cell-basedmicro-arraychipsystems)。
熒光標(biāo)記抗原多參數(shù)細(xì)胞分選法與熒光激活細(xì)胞分選法類似，二者差異在于前者在加入用于標(biāo)記B細(xì)胞表面抗原的熒光抗體之外，還需加入熒光標(biāo)記的目標(biāo)抗原用來結(jié)合B細(xì)胞表面的膜抗體，以分選目標(biāo)抗原特異性的B細(xì)胞。它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，此技術(shù)不僅提高分離細(xì)胞的純度，而且可以得到更多的細(xì)胞信息，分選各個時期的B細(xì)胞用于不同的研究方向。該方法具有速度快、精度高、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析分選技術(shù)。
抗原標(biāo)記磁珠分選法基本原理是基于細(xì)胞表面目標(biāo)抗原特異性抗體能與連接有磁珠的目標(biāo)抗原相結(jié)合，在外加磁場中，通過目標(biāo)抗原與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面特異性抗體的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的目標(biāo)抗原結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出高純度的細(xì)胞，在流式分選單細(xì)胞前可用磁珠分選法進(jìn)行預(yù)分離，但是由于磁珠影響細(xì)胞生物活性因而不利于分離后培養(yǎng)與操作。
微雕法基于軟光刻(Softlithographic)微陣列芯片識別、恢復(fù)和克隆產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細(xì)胞，刺激多克隆B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并將其逐個置于芯片孔內(nèi)，將該芯片轉(zhuǎn)印至相應(yīng)的蛋白芯片后，即可用熒光標(biāo)記的目標(biāo)抗原識別特異性抗體，進(jìn)而顯微操作將檢測到的分泌目標(biāo)抗原特異性抗體B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)克隆操作。
微陣列芯片法同微雕法具有高通量(每個芯片分選細(xì)胞量高達(dá)10萬個細(xì)胞)、快速、成本低、可直接從多克隆B細(xì)胞中分選并鑒定抗體分泌B細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微陣列芯片法(Immunospotarrayassayonachip，ISAAC)是微陣列芯片法的延伸和補(bǔ)充，該方法用包被于芯片表面的抗免疫球蛋白抗體來代替微雕法轉(zhuǎn)印蛋白芯片的過程，抗免疫球蛋白抗體能夠快速捕捉抗體分泌B細(xì)胞分泌的抗體，進(jìn)而用生物素標(biāo)記的目標(biāo)抗原識別特異性抗體，從而達(dá)到篩選并分離特異性抗體分泌B細(xì)胞的目的。ISAAC法較微雕法另一改進(jìn)在于，前者能在同一塊芯片上篩選針對多種不同目標(biāo)抗原的特異性抗體，簡化了實驗過程且更加高效，是目前前景非常廣闊的分選B細(xì)胞方法。

擴(kuò)增和克隆抗體基因
經(jīng)典克隆未知抗體基因的方法（如cDNA文庫篩選等）有著共同的缺點(diǎn)——操作繁瑣、周期較長、工作量大。近些年隨著PCR技術(shù)的快速興起和成熟，單個B細(xì)胞抗體基因的擴(kuò)增和克隆也隨之發(fā)展。
細(xì)胞分選時，通常需將單個B細(xì)胞分至內(nèi)含適量細(xì)胞裂解液、RNA酶抑制劑和PCR反應(yīng)試劑的適當(dāng)容器中，如96孔板。由于單個細(xì)胞內(nèi)RNA含量少，適當(dāng)?shù)娜萜骺梢苑奖愦笈坎僮鞣乐箻悠窊p失或交叉污染。另外，不同類型B細(xì)胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B細(xì)胞中抗體基因轉(zhuǎn)錄本含量遠(yuǎn)高于記憶B細(xì)胞，因此從抗體分泌B細(xì)胞中更容易擴(kuò)增得到抗體基因。
通常從單個B細(xì)胞中擴(kuò)增未知抗體基因，需使用合適的引物進(jìn)行巢式或半巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR(Nestedorsemi-nestedRT-PCR)，該過程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴(kuò)增又能擴(kuò)增出完整的抗體基因序列，因此合理設(shè)計引物序列至關(guān)重要。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導(dǎo)序列設(shè)計前向引物的混合物，反向引物特異性互補(bǔ)于抗體恒定區(qū)。根據(jù)實驗?zāi)康?，如果分離和擴(kuò)增不同同種型的抗體，反向弓物則是特異性互補(bǔ)于各種同種型抗體恒定區(qū)的混合物。除此之外，為方便重疊延伸PCR重組和酶切克隆抗體重鏈輕鏈可變區(qū)基因，前向引物5端和反向引物3端需要包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

表達(dá)、篩選和鑒定抗原特異性抗體
鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達(dá)載體在相應(yīng)系統(tǒng)中表達(dá)，最簡單常用的是原核表達(dá)系統(tǒng)，如Escherichiacoli，相較而言，真核表達(dá)系統(tǒng)尤其是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高，常用的有HEK293和CHO等細(xì)胞系。通過親和層析和離子交換層析純化到的抗體，可通過SDS-PAGE，Westernblotting，ELISA等常規(guī)方法篩選和鑒定抗體，也可通過免疫沉淀(Immunoprecipitation)、空斑法(Plaqueassay)、空斑減少中和測定法(PRNT50assay)、流式分析法(FACSanalysis)、活細(xì)胞成像測定法(Livecellimagingassays)、體內(nèi)藥物活性測定法等方法進(jìn)一步測定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性保護(hù)活性等生物學(xué)特性。

在過去的40年里，隨著單克隆抗體在各個領(lǐng)域的研究和應(yīng)用日趨廣泛。而近10年來，隨著基于單細(xì)胞的抗體制備相關(guān)技術(shù)的開發(fā)和完善，單個B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)已逐漸成為單克隆抗體制備的主要技術(shù)。單個B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)作為未來單克隆抗體制備的主流技術(shù)，各階段的方法和環(huán)節(jié)都存在著極大的進(jìn)展空間，所制備的單克隆抗體也具有無限的開發(fā)和應(yīng)用前景。



參考文獻(xiàn)
ChiXY，YuCM，ChenW.SingleBcellmonoclonalantibodytechnologiesandapplications.ChinJBiotech，2012，28(6):651−660.