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膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中含量最多的蛋白質(zhì)，至今已發(fā)現(xiàn)28種類型，主要分為纖維性膠原蛋白、網(wǎng)狀膠原蛋白、珠狀絲狀膠原蛋白、錨定纖維蛋白、膜蛋白以及multiplexins膠原蛋白，其中纖維性膠原蛋白中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80%~90%。

膠原蛋白是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)，在人體中含量豐富，占人體蛋白質(zhì)三分之一，占皮膚干重四分之三，對(duì)于骨骼、皮膚、關(guān)節(jié)起關(guān)鍵的連接作用。除了結(jié)構(gòu)上的作用外，膠原蛋白還可以與各種大分子如整合素、裝飾蛋白、纖維連接蛋白、肝素和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）發(fā)生相互作用，在調(diào)節(jié)組織再生過(guò)程中十分重要。

作為哺乳動(dòng)物含量最豐富的蛋白質(zhì)，膠原蛋白為哺乳動(dòng)物組織提供主要的結(jié)構(gòu)與機(jī)械支持，是一種結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的蛋白質(zhì)，基于其開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化妝品、皮革、生物科技等行業(yè)。膠原蛋白作為一種生物聚合物，還可以與其他親水性聚合物混合形成高質(zhì)量水凝膠和可生物降解的支架，其中膠原蛋白與殼聚糖共混物的制備已經(jīng)成為科學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注的課題。目前，根據(jù)來(lái)源，膠原蛋白大致分為動(dòng)物源膠原蛋白和重組膠原蛋白。動(dòng)物源膠原蛋白主要來(lái)源于陸生動(dòng)物以及海洋動(dòng)物，而重組膠原蛋白是指將人膠原蛋白基因克隆到選定的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞內(nèi)，最后通過(guò)純化技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)。

膠原蛋白是含有三螺旋結(jié)構(gòu)的纖維狀膠原蛋白，約占蛋白總質(zhì)量的三分之一，其中哺乳動(dòng)物中膠原蛋白含量最高的是肌腱（80%），其次是皮膚（70%）、骨骼（25%）以及主動(dòng)脈（20%）。膠原蛋白的基本組成單位是由3條α鏈組成的原膠原。正是由于原膠原分子中3個(gè)平行α鏈以一個(gè)接一個(gè)殘基交錯(cuò)形成的聚脯氨酸Ⅱ型（PPⅡ）左手螺旋構(gòu)象決定了膠原蛋白結(jié)構(gòu)。擁有正確折疊的三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用至關(guān)重要。在三螺旋結(jié)構(gòu)中每一個(gè)α鏈都由重復(fù)肽三聯(lián)體（Gly-Xaa-Yaa）組成，其中Xaa和Yaa通常是脯氨酸和羥脯氨酸。由于高度螺旋化，三聯(lián)體中的3個(gè)氨基酸殘基在螺旋內(nèi)部占據(jù)不同的位置。其中，甘氨酸殘基埋藏在中心，溶劑不容易進(jìn)入；Xaa位置的氨基酸殘基高度暴露于溶劑中；Yaa位置由于靠近相鄰鏈，因此被溶劑接觸的可能性較低。對(duì)Gly-Xaa-Yaa的大量研究揭示了影響膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多重因素，這些因素包括3條鏈條的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水合網(wǎng)絡(luò)以及高含量的脯氨酸和羥脯氨酸形成。

膠原蛋白作為最豐富的動(dòng)物蛋白，至今已發(fā)現(xiàn)28種類型，而根據(jù)膠原蛋白所形成具有不同活性的形態(tài)結(jié)構(gòu)可將膠原蛋白類型大致分為纖維性膠原蛋白與非纖維性膠原蛋白。纖維性膠原蛋白中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80%～90%。Ⅰ型膠原蛋白作為人體中最常見(jiàn)的膠原蛋白，主要分布在皮膚、肌腱和骨骼中，Ⅱ型主要分布在軟骨中，Ⅲ型主要分布在皮膚和血管系統(tǒng)中。
膠原蛋白類型、分布及功能

膠原蛋白的形成始于膠原蛋白編碼基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等作用形成新生膠原蛋白α鏈（稱為前α鏈），膠原蛋白前α鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先后經(jīng)歷脯氨酸-4-羥化酶（P4H）與賴氨酸羥化酶（LH）的修飾作用，使Gly-Xaa-Yaa中Yaa位上的脯氨酸殘基與賴氨酸殘基分別羥基化，而一部分羥基化賴氨酸殘基則進(jìn)一步糖基化。脯氨酸羥基化和賴氨酸羥基化分別是實(shí)現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和細(xì)胞外成熟膠原交聯(lián)的必需步驟。若新生膠原蛋白α鏈羥基化出現(xiàn)畸形，形成的不良膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)將在細(xì)胞內(nèi)堆積，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。除了P4H與LH作用外，前膠原蛋白α鏈還需要脯氨酸-3-羥化酶（P3H）進(jìn)行修飾。隨后，3條膠原蛋白前α鏈的C端前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯(lián)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶PDI的協(xié)同作用下形成的二硫鍵，并將膠原蛋白α單鏈三聚體化，形成三螺旋構(gòu)象，這種構(gòu)象從C端一直持續(xù)到N端。同時(shí)，膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47與三螺旋前膠原蛋白相互作用，防止前膠原蛋白局部展開(kāi)和聚集。經(jīng)膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47作用后，前膠原蛋白被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口TANGO1識(shí)別，運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中。在高爾基體中，HSP47從前膠原蛋白解離，并通過(guò)KDEL（REDL）受體返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。同時(shí)，高爾基體將前膠原蛋白運(yùn)送分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，通過(guò)N端酶與C端酶的共同作用將前膠原蛋白多余N端與C端前肽進(jìn)行切除，形成完整的膠原蛋白分子。

膠原蛋白合成機(jī)制圖

重組膠原蛋白的表達(dá)體系主要包括原核生物（主要為大腸桿菌）、酵母、植物、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系?，F(xiàn)階段表達(dá)體系中以大腸桿菌、酵母為主，但高效的大腸桿菌、酵母等表達(dá)體系缺乏動(dòng)物細(xì)胞中膠原蛋白翻譯后修飾，需要添加相對(duì)應(yīng)的重組酶。而植物、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系所產(chǎn)生膠原蛋白含量雖然遠(yuǎn)低于大腸桿菌、酵母體系，但具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)和較好的熱穩(wěn)定性。不同重組膠原蛋白表達(dá)體系表達(dá)膠原蛋白所需成本仍有比較大的區(qū)別，植物表達(dá)體系因其具備光合作用自生產(chǎn)能力，其表達(dá)膠原蛋白成本相對(duì)較低；大腸桿菌以及酵母雖然具備一定發(fā)酵成本，但由于其表達(dá)產(chǎn)量較高，表達(dá)單位膠原蛋白所需成本也較低，但表達(dá)的膠原蛋白缺乏羥基化及相應(yīng)活性；昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)體系由于其表達(dá)量少，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，因此其表達(dá)單位膠原蛋白成本較高；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系屬于高級(jí)重組表達(dá)體系，由于其表達(dá)體系復(fù)雜，培養(yǎng)要求高，因此其表達(dá)單位膠原蛋白的成本也較高。

重組膠原蛋白相較于傳統(tǒng)動(dòng)物提取膠原蛋白，具有更高親水性、更高生物活性區(qū)域、更優(yōu)異的抗氧化性能以及止血與促傷口愈合能力。重組膠原蛋白自研發(fā)以來(lái)，在生物醫(yī)藥工程中得到廣泛的應(yīng)用。
在皮膚修復(fù)上，Zhao等發(fā)明的MTGase交聯(lián)重組類人膠原蛋白水凝膠具有良好的生物相容性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)該材料具備較低的毒性，有望作為水凝膠材料修復(fù)皮膚損傷。Pan等通過(guò)反復(fù)凍融聚乙烯醇、重組人類膠原蛋白與羧甲基殼聚糖的混合液得到水凝膠敷料，該敷料與商業(yè)敷料相比，能顯著促進(jìn)全層皮膚傷口愈合，顯示了其作為皮膚創(chuàng)面愈合創(chuàng)面敷料的巨大潛力。Woodly等通過(guò)獲得重組人Ⅶ型膠原蛋白，將其遷移到隱性營(yíng)養(yǎng)不良大皰性表皮松解癥患者的真皮-表皮交界處，有效預(yù)防皮膚起泡與糜爛的形成；Dong等在近年來(lái)證實(shí)將重組類人膠原蛋白與重組類人纖連蛋白聯(lián)合治療C57BL/6小鼠的急性傷口的效果高于兩者單獨(dú)治療效果，為重組膠原在皮膚治療修復(fù)方面開(kāi)辟了嶄新道路。McLaughlin等通過(guò)將重組人Ⅰ型膠原蛋白與重組人Ⅲ型膠原蛋白制成可注射生物材料，將二者注入到心肌梗死增殖后期的小鼠身上，發(fā)現(xiàn)使用重組人Ⅰ型膠原蛋作為注射材料可以有效促進(jìn)愈合環(huán)境、心肌細(xì)胞存活以及減少心肌病理性重塑，有利于實(shí)現(xiàn)心肌梗死后重塑。

在眼科疾病上，Fagerholm等利用重組膠原蛋白植入10名圓錐角膜或角膜瘢痕患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有患者淚膜得到恢復(fù)，基質(zhì)細(xì)胞被招募到植入物中。還觀察到患者神經(jīng)再生和觸摸敏感性恢復(fù)，與人類供體組織相比，兩者都達(dá)到更高的程度。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，生物合成角膜植入物可以提供一種安全有效的替代人體組織植入的方法，幫助解決目前供體角膜短缺的問(wèn)題。隨后兩年，F(xiàn)agerholm團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種由碳二亞胺交聯(lián)重組人膠原蛋白組成的無(wú)細(xì)胞植入物，通過(guò)植入眼角膜細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了角膜再生，在4年多的時(shí)間里，再生的新角膜穩(wěn)定整合在一起，無(wú)排斥反應(yīng)，也沒(méi)有發(fā)生供體角膜患者所需的長(zhǎng)期免疫抑制機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，由碳二亞胺交聯(lián)重組人膠原蛋白組成的無(wú)細(xì)胞植入物可以實(shí)現(xiàn)角膜的再生。因此，重組人膠原蛋白可作為良好的角膜修復(fù)植入物。

目前，重組膠原蛋白由于具有較好的生物相容性、更高的安全性以及對(duì)皮膚保濕修復(fù)明顯的特點(diǎn)，在膠原蛋白家族中占有重要地位。隨著分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程等的學(xué)科發(fā)展，重組膠原蛋白的研究將進(jìn)一步深入，最終為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供更優(yōu)質(zhì)、更安全、更廉價(jià)的重組膠原蛋白原料。

參考文獻(xiàn)：
PAN Jiahao, PAN Weisong, QIU Jian, XIE Donling, ZOU Qi, WU Chuan. Research progress on recombinant collagen expression system. Synthetic Biology Journal[J], 2023, 4(4): 808-823 doi:10.12211/2096-8280.2023-020

 

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