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用于疾病的人源化抗體制備技術(shù)的發(fā)展

發(fā)表時(shí)間:2023-12-06 訪問次數(shù):439

單克隆monoclonalantibodymAbB細(xì)胞產(chǎn)生的、由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成的Y形結(jié)構(gòu)蛋白。其中原結(jié)合片段(antigenbindingfragments,Fab)由一條重鏈和一條輕鏈的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,CDR)組成Fab段決定了抗體結(jié)合抗原的特異性和親和力;單抗的恒定區(qū)(Fc)通過結(jié)合細(xì)胞表面Fc受體來發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(complementdependentcytotoxicityCDC)等功能。

目前,治療性單抗已廣泛應(yīng)用于癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等多種疾病,為許多患者帶來了全新的希望。由于人抗鼠(humanantimouseantibody,HAMA)反應(yīng)的存在,抑制了鼠單抗的臨床應(yīng)用,因此涌現(xiàn)了一系列抗體工程技術(shù),如抗體人源化、噬菌體展示、轉(zhuǎn)基因小鼠、單細(xì)胞PCR等技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)鼠單抗人源化改造以及親和力提高,或者直接篩選制備人源化/全人抗體,加速了單抗的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。

抗體人源化
全人、人源化和鼠源抗體分別占臨床應(yīng)用單抗的51%、46%3%,可見人源化和全人單抗已經(jīng)成為治療性抗體研發(fā)的主流。人源化抗體具有免疫原性低,體內(nèi)半衰期長,有效誘導(dǎo)ADCCCDC效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。早期的人源化技術(shù)是將鼠單抗的可變區(qū)與人抗恒定區(qū)相連從而獲得嵌合抗體。選擇性阻斷血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體阿昔單抗(Abciximab)于1994年被美國FDA批準(zhǔn)用于抑制血小板聚集,成為第一個(gè)嵌合抗體藥物,抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗于1997年被美國FDA批準(zhǔn)用于非霍奇金淋巴瘤,成為首個(gè)用于腫瘤的嵌合抗體。
為了提高抗體人源化程度,CDR移植技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,將除了CDR區(qū)以外的序列替換為人源(如果鼠抗FR框架中的某些氨基酸對(duì)維持抗原的識(shí)別至關(guān)重要,那么這些殘基也需要保留),進(jìn)一步降低免疫原性。FDA1997年批準(zhǔn)的首個(gè)用于預(yù)防移植排斥反應(yīng)人源化單抗——IL-2受體抗體達(dá)利珠單抗(Daclizumab),而最著名的人源化抗體當(dāng)屬1998年獲批的抗HER2單抗曲妥珠單抗Herceptin,從誕生以來連續(xù)登上十大藥物暢銷榜。
目前,普健生物提供完善的抗體人源化服務(wù),僅需提供原始抗體序列,普健可幫助客戶通過成熟的方法分析抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu),了解直接作用的關(guān)鍵殘基,完成人源化抗體設(shè)計(jì),通過一站式抗體平臺(tái)完成基因合成及克隆、瞬轉(zhuǎn)表達(dá)純化等服務(wù),并形成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)
1、普健生物擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的抗體人源化團(tuán)隊(duì),團(tuán)隊(duì)的技術(shù)專家曾經(jīng)成功研制上市的治療性抗體藥物
2、普健生物擁有自主開發(fā)的高表達(dá)載體及細(xì)胞系,以及具有商業(yè)開發(fā)license的細(xì)胞系
3、普健生物具有一站式從細(xì)胞系開發(fā),到發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化,再到150L細(xì)胞罐發(fā)酵,完成整個(gè)治療性抗體的研發(fā)能力


噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)是基于噬菌體表面蛋白(如PⅢ蛋白)的結(jié)構(gòu)及包裝特點(diǎn),將外源抗體基因和外殼蛋白融合表達(dá)并展示在鞭毛表面,實(shí)現(xiàn)靶抗原特異性抗體的快速篩選。1985年,GeorgeP.Smith使用重組DNA技術(shù),將外源肽與噬菌體M13的外殼蛋白PⅢ融合,在噬菌體表面展示肽。此后他創(chuàng)建了抗體選擇性噬菌體載體,能夠從1×108庫容噬菌體池中篩選特異性抗體。噬菌體展示抗體的形式可以是單鏈抗體(singlechainantibodyfragmentscFv)或Fab片段,scFvVHVL組成,二者之間由一個(gè)短而靈活的連接肽相連,而Fab具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性,其結(jié)合能力與完整的IgG抗體相當(dāng)。
由于噬菌體顆粒小、容易擴(kuò)增和富集,溶解度高(1×1013pfu/mL),因此可以實(shí)現(xiàn)抗體的大容量展示。噬菌體展示文庫的基因庫可以從原始或免疫人類或動(dòng)物中獲得,也可以使用隨機(jī)CDR合成法構(gòu)建文庫,只要庫容足夠大,都可以產(chǎn)生針對(duì)多種抗原靶點(diǎn)的高親和力抗體(親和力達(dá)納摩爾級(jí))。普健生物基于豐富的噬菌體抗體技術(shù)經(jīng)驗(yàn)以及上百個(gè)噬菌體展示抗體項(xiàng)目成功開發(fā)經(jīng)驗(yàn),具有全人源重組抗體庫,庫容高達(dá)千億級(jí)別(1011pfu,支持兩步建庫法,保證了文庫的多樣性,抗體庫片段插入正確率高,可以兩周拿到全人源重組抗體,并支持構(gòu)建多種物種(人源、小鼠、兔子、羊駝等)、多種類型(scfv、FabVHH)的抗體文庫。


FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了種從噬菌體展示文庫中獲得的全人抗體。2002年獲批上市的阿達(dá)木單抗(Adalimumab,迄今仍是世界上最暢銷的藥物

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是全人抗體的又一重要來源,通過對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行基因改造,將人類免疫球蛋白(Ig)基因取代動(dòng)物內(nèi)源性Ig基因,使這些動(dòng)物在免疫后能夠合成人類抗體。首個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠來源的全人抗體帕尼單抗Panitumab是抗EGFR抗體,于2006年獲得美國FDA批準(zhǔn)。同樣來源于轉(zhuǎn)因因動(dòng)物技術(shù)的還有2種用于自身免疫性皮膚病的人抗:IL-17α抗體司庫奇尤單抗Secukinumab以及IL-17R抗體柏達(dá)魯單抗Brodalumab,分別于2015年和2017年獲得美國FDA批準(zhǔn)用于銀屑病。

B細(xì)胞抗體技術(shù)
使用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)、抗體庫或轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)生產(chǎn)治療性人類抗體往往需要長期的免疫程序和多輪篩選,而單細(xì)胞抗體技術(shù)可以從外周血中直接進(jìn)行陽性細(xì)胞分選和抗體基因克隆,直接進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)步驟,因此在突發(fā)傳染病等緊急情況下,單B細(xì)胞抗體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)尤為明顯。普健生物新型的Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)平臺(tái),利用B細(xì)胞分選富集策略,在流式分選設(shè)備的支持下,有效富集抗原特異性B細(xì)胞,提高B細(xì)胞體外培養(yǎng)的成活率,保留B細(xì)胞的多樣性,可開發(fā)出不同應(yīng)用需求的抗體。
案例展示:

 

_ A B C D
EC50(ng/ml) 6.897 145 15.48 23.43
 


總體而言,治療性抗體領(lǐng)域發(fā)展迅速,擁有巨大的發(fā)展?jié)摿Α;谝延械膯慰寡邪l(fā)技術(shù),結(jié)合下一代測序技術(shù)、高通量篩選、抗體恒定區(qū)改造技術(shù),借鑒新型支架蛋白、修飾抗體以
及抗體分子設(shè)計(jì)等經(jīng)驗(yàn),可以最大限度地提高抗體藥物的療效和安全性,展現(xiàn)最優(yōu)藥效、藥代及藥理特性。

參考文獻(xiàn)
[1]FENGJiannan,QIAOChunxia.Progression on research technology of human therapeutic antibody.[J].Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences),2020,40(11):1571-1574.