摘要：
高等脊椎動物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因編碼，催化酪氨酸殘基去磷酸化，與其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種信號通路的信號傳導(dǎo)。以往研究表明，SHP2在高等脊椎動物T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。


蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases， PTPs)具有催化蛋白酪氨酸殘基去磷酸化的功能，與能夠催化蛋白酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases， PTKs)作用相反。在兩者的共同作用下，蛋白酪氨酸殘基發(fā)生可逆磷酸化，從而可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜酶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對生物的生長發(fā)育具有重要意義。研究表明PTKs主要與致癌和促腫瘤活性相關(guān)，而PTPs通常在各種人類腫瘤細(xì)胞中發(fā)生突變或異?；罨?/font>，表明其正常功能的維持會對腫瘤的發(fā)展起一定的抑制作用。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是PTP家族中的一員，也是第一個被證實的原癌基因，廣泛表達于各種組織中，參與多種生物學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是脊椎動物發(fā)育中不可缺少的胞內(nèi)非受體型PTP。人類SHP2蛋白由ptpn11基因編碼，其氨基酸序列具有一個N端Src同源2 (N-terminal Src homology 2， N-SH2)結(jié)構(gòu)域、一個與N-SH2結(jié)構(gòu)域相鄰的C-SH2結(jié)構(gòu)域和一個跨度比較大的PTP結(jié)構(gòu)域。在SHP2分子的C端有兩個磷酸化位點(Y542與Y580)和一個富含脯氨酸基序的尾部。N-SH2結(jié)構(gòu)域是一種構(gòu)象開關(guān)，在正常生理條件下，SHP2的N-SH2結(jié)構(gòu)域與其自身的PTP結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，抑制其磷酸酶活性。然而，SHP2如果通過其SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化生長因子受體或接頭蛋白結(jié)合則會導(dǎo)致這種分子內(nèi)相互作用被破壞，使其PTP結(jié)構(gòu)域上的催化活性中心暴露，從而激活其磷酸酶活性。通過串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域識別雙磷酸化的配體是該開關(guān)的組成部分；而C端SH2結(jié)構(gòu)域雖然有助于提高結(jié)合能和特異性，但它被激活后并不能直接起作用。

SHP2是一種分布廣泛的酪氨酸磷酸酶，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與細(xì)胞內(nèi)由各種生長因子、激素或細(xì)胞因子介導(dǎo)的重要的信號通路。如SHP2可以促進小GTP結(jié)合蛋白(Rat sarcoma， Ras)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)途徑激活，而Ras/MAPK通路對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子的刺激后，SHP2作為正調(diào)控因子促進受體酪氨酸激酶激活的下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， Erk)/MAPK信號通路，也可以增強由細(xì)胞因子IL-21激活的細(xì)胞增殖過程中ERK1/2信號傳導(dǎo)活性。體外實驗證明，SHP2也能夠通過正向調(diào)控絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt (serine/threonine protein kinases Akt， Akt)和Erk1/2信號傳導(dǎo)促進少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟。SHP2在導(dǎo)致Erk激活的各種促有絲分裂信號傳導(dǎo)途徑中起著正調(diào)控作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)SHP2在介導(dǎo)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)和下游c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases， JNK)信號通路的激活方面具有負(fù)調(diào)控作用。這也是酪氨酸磷酸酶SHP2在介導(dǎo)Erk和JNK、MAPK活化中具有負(fù)調(diào)控作用的第一個證據(jù)。另外，SHP2在高等動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。Hoff等發(fā)現(xiàn)SHP-2在T細(xì)胞受體(T cell receptor， TCR)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用，促進炎癥細(xì)胞因子的分泌、趨化因子誘導(dǎo)的遷移以及活化細(xì)胞的凋亡。

七鰓鰻(Petromyzoniformes)作為目前世界上僅存的最原始無頜類脊椎動物之一，承接了從無脊椎動物到脊椎動物的進化歷程，被稱為“活化石”。由于其在進化上的特殊地位，七鰓鰻成為研究脊椎動物起源與進化的關(guān)鍵物種。研究證明，在七鰓鰻體內(nèi)不僅存在著先天性免疫，同時存在著適應(yīng)性免疫，而七鰓鰻的適應(yīng)性免疫不同于高等脊椎動物。高等脊椎動物的適應(yīng)性免疫依賴于免疫球蛋白(Ig)及TCR和B細(xì)胞受體(BCR)分子介導(dǎo)，七鰓鰻的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)則是由可變淋巴受體(variable lymphocyte receptors， VLR)介導(dǎo)。在無頜類脊椎動物中，其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中最顯著的特征是使用富含亮氨酸的重復(fù)模塊來組裝可變淋巴細(xì)胞受體基因(VLRA、VLR B和VLRC)。為了更加清晰地了解無頜類脊椎動物是否存在作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)的重要調(diào)控因子SHP2，本研究在日本七鰓鰻(Lampetra japonica)中克隆并鑒定了與高等脊椎動物SHP2同源的分子，研究SHP2在日本七鰓鰻免疫應(yīng)答過程中的作用，揭示SHP2家族的系統(tǒng)發(fā)生，為探索高等脊椎動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生及其進化歷程提供一定的線索。

來自遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、大連工業(yè)大學(xué)的研究人員通過PCR 擴增獲取其Lja-SHP2開放閱讀框序列，并構(gòu)建到原核表達載體 pET-32a中，成功在大腸桿菌中實現(xiàn)重組蛋白表達并制備了其兔源多克隆抗體。用混合菌免疫刺激日本七鰓鰻后，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡方法檢測了Lja-SHP2在日本七鰓鰻免疫相關(guān)組織中mRNA和蛋白水平表達譜。結(jié)果顯示，混合菌免疫刺激后，Lja-SHP2 mRNA和蛋白表達在外周血白細(xì)胞和髓樣小體中無顯著變化，而在鰓組織中顯著性上調(diào)(P<0.05)，說明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要參與了鰓組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了進一步探究Lja-SHP2與淋巴細(xì)胞亞群免疫應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)性，本研究分別使用B細(xì)胞有絲分裂原脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)和T細(xì)胞的有絲分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin， PHA)免疫刺激日本七鰓鰻。經(jīng)LPS免疫刺激后，與對照組相比，白細(xì)胞中Lja-SHP2蛋白表達顯著上調(diào)，鰓組織和髓樣小體沒有顯著性差異表達;但經(jīng)PHA免疫刺激后，與對照組相比，白細(xì)胞、鰓組織和髓樣小體3種組織中Lja-SHP2均有上調(diào)，尤其在白細(xì)胞中上調(diào)最為顯著，大約是對照組的2.5倍，說明Lja-SHP2參與了日本七鰓鰻由PHA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。由于PHA能刺激日本七鰓鰻鰓組織中VLRA +淋巴細(xì)胞的活化，這表明Lja-SHP2可能參與了PHA介導(dǎo)的VLRA +淋巴細(xì)胞亞群的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

SDS-PAGE檢測Lja-SHP2的重組表達、可溶性及純化結(jié)果

Lja-SHP2多克隆抗體效價與特異性檢測

 Lja-SHP2 mRNA和蛋白質(zhì)在各免疫相關(guān)組織中的相對表達量

SHP2作為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，參與多條信號通路，如RAS/MAPK通路、PI3K/AKT通路及JAK/STAT通路等，不僅為脊椎動物胚胎發(fā)育所必需，而且也參與多種組織特異性細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的調(diào)控。SHP2也是一種特殊的蛋白酪氨酸磷酸酶，它既可以作為正調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也可以在特定條件下發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常T細(xì)胞相比，在缺失ptpn11的T細(xì)胞中Erk激酶活化受到阻礙;表明SHP2通過調(diào)節(jié)Erk途徑促進TCR信號傳導(dǎo)，是pre-TCR和TCR促進T細(xì)胞成熟和增殖的常用信號傳感器。另外，SHP2通過介導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)育和功能參與多種信號傳導(dǎo)途徑，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子依賴性粒細(xì)胞生成，也是嗜酸性粒細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。