经典a三级在线理论香港_宅男网站免费在线看_2020最新国自产拍视频网站_av在 在线播放

首頁 / 資料下載 / 知識百科

雞HNF 3β重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達及其抗體制備

發(fā)表時間:2024-01-10 訪問次數(shù):396

肝核因子3β (hepatocyte nuclear factor 3β, HNF 3β)作為一個重要的轉錄調控因子,參與哺乳動物的前腸胚和肝臟發(fā)育以及成體肝內的能量代謝,而HNF 3β在雞(Gallus gallus)中的功能還不清楚。

肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)包含HNF1HNF2、HNF3HNF4、HNF6和“CCAT增強子結合蛋白,形成一個轉錄網(wǎng)絡,調控肝細胞的分化,在胚胎發(fā)育和肝內代謝平衡中發(fā)揮重要作用。HNF 3β又稱Forkheadbox A2 (FOXA2),是轉錄調控因子3家族的一員,協(xié)同HNF 3α(FOXA1)促進前腸內胚層的建立和啟動肝臟的發(fā)育HNF 3β對成年小鼠(Mus musculus)肝內葡萄糖和脂類的平衡有著重要作用;HNF 3β缺陷還會影響胚泡著床和基質細胞蛻膜化,造成完全不育。

目前大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統(tǒng)是原核表達體系中最早被應用、也是最為成熟和應用最廣的一種工程性表達外源蛋白的體系,其具有宿主細胞增殖速度快、操作方便、誘導調控表達機制清晰可控及外源蛋白產量高等優(yōu)勢。目前關于雞HNF 3β的功能還知之甚少,特別是HNF 3β在繁育和能量代謝方面是否也具有重要作用?這是值得去研究和弄清楚的問題。而雞HNF 3β有效抗體的缺乏,限制了對其功能的研究。為此,來自常熟理工學院的研究人員以大腸桿菌進行工程性表達雞HNF 3β重組蛋白,并制備其抗體,為進一步研究雞HNF 3β與靶基因的互作作用、揭示其功能提供重要的物質基礎。

本研究中,研究人員通過優(yōu)化合成了雞Hnf 3β基因編碼區(qū)片段,以pET 30a表達載體在大腸桿菌(Escherichia coli)中進行重組蛋白HNF 3β的表達,用6 mol/L尿素變性包涵體,Ni2+對重組蛋白進行親和層析,并以快速稀釋法復性重組蛋白,以離心超濾法收集、濃縮目的蛋白;取純化的HNF 3β重組蛋白和弗氏佐劑乳化后免疫兔(Oryctolagus cuniculus),制備雞HNF 3β的抗血清,以酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定抗血清效價后,用Protein A法純化抗體;通過檢測雞肝癌細胞系(leghorn male hepatoma, LMH)HNF 3β蛋白的表達情況驗證所制備抗體的效果。

結果表明,優(yōu)化合成的Hnf 3β基因片段在大腸桿菌中實現(xiàn)了重組蛋白的高效表達;在6 mol/L尿素的變性條件下,Ni2+親和層析一步法獲得純度大于95%的重組蛋白,結合快速稀釋法獲得了可溶性的重組蛋白HNF 3β;經重組蛋白4次免疫后,抗血清效價超過164 000;免疫印跡結果顯示,制備的抗體能特異性的檢測出LMH細胞中HNF 3β蛋白的表達。綜上所述,本研究利用制備的高純度重組蛋白HNF3β免疫兔獲得了高特異性和高效價的多克隆抗體,可以為檢測雞HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗體。

這項研究根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏愛性優(yōu)化了雞Hnf 3β基因的編碼區(qū)片段序列,該優(yōu)化的片段。提高了雞HNF 3β重組蛋白在大腸桿菌中的表達,快速稀釋復性蛋白的方法能有效地從包涵體中獲得高純度的可溶性HNF 3β重組蛋白;純度95%以上的重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得了較高效價的多克隆抗體,Protein A一步法制備、純化了HNF3β的多克隆抗體,抗體對HNF 3β蛋白具有較高的特異性和效價,可利用此抗體檢測雞HNF 3β蛋白分子及研究HNF 3β的功能。


參考文獻
[1]張景,潘玲,毛威威等.HNF 3β重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達及其抗體制備[J].農業(yè)生物技術學報,2022,30(04):809-816.