噬菌體抗體庫篩選

發(fā)表時間：2022-01-22 訪問次數(shù)：2532

　　本案例基于普健生物大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，采用pET28b載體，融合表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌的3個蛋白(A+B+C，中間用GGGGS接頭連接，N端添加6*His標(biāo)簽用于蛋白純化)作為免疫原免疫了2只新西蘭大白兔，構(gòu)建了庫容高達(dá)1.56×10^10 CFU的噬菌體展示兔scFV抗體文庫，并用A-B-C蛋白作為篩選原，淘選得到了4條不同的針對A蛋白的抗體序列交付客戶。

　　1.抗原制備

　　A蛋白分析：

　　A蛋白一共228AAs; 1-23 AAs為信號肽，分子量22kDa，疏水性一般; 普健生物選取的表達(dá)區(qū)段為23-228 AAs;

　　蛋白A信號肽分析結(jié)果：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

　　蛋白A疏水性分析結(jié)果：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

　　B蛋白分析：

　　B蛋白一共95AAs，無信號肽，9.9kDa，有2個跨膜區(qū)，疏水性很強; 普健生物選取的表達(dá)區(qū)段為全長;

　　噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

蛋白B結(jié)構(gòu)示意圖

　　C蛋白分析：

　　C蛋白一共100 AAs; 無信號肽，分子量10.79 kDa，有1個無序區(qū)，疏水性較強; 普健生物選取的表達(dá)區(qū)段為全長;

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

蛋白C結(jié)構(gòu)示意圖

　　表達(dá)的融合蛋白序列示意圖如下：

　　>His-A-B-C(421 AAs;44.97 kDa;pI:4.85)

　　MGSHHHHHHSG-A-GGGGS-B-GGGGS-C

　　通過密碼子優(yōu)化及基因合成，亞克隆，表達(dá)純化，得到的融合蛋白質(zhì)檢圖如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

　　A. 考馬斯亮藍(lán)染色. B. His 標(biāo)簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).

　　緩沖液：PBS pH7.5; 純度：>90%; 濃度:1mg/ml

　　2.兔scFv抗體庫構(gòu)建

　　(1)免疫新西蘭大白兔

　　將融合蛋白免疫兩只兔子，共免疫四次，免疫間隔兩周，檢測第三次和第四次的免疫效價，效價達(dá)到要求后(大于 1:32000)進(jìn)行采血，效價結(jié)果如下：

稀釋比例	兔子 A			兔子B
稀釋比例	免疫前血清	3免血清	4免血清	免疫前血清	3免血清	4免血清
500	0.02	2.94	3.14	0.04	3.04	3.16
1000	0.01	2.73	2.93	0.02	2.93	2.94
2000	0.01	2.20	2.30	0.01	2.80	2.30
4000	0.01	1.84	1.94	0.01	1.94	1.93
8000	0.01	1.34	1.64	0.01	1.64	1.65
16000	0.01	1.15	1.55	0.01	1.45	1.55
32000	0.01	0.68	0.78	0.01	0.78	0.79
64000	0.01	0.43	0.63	0.01	0.63	0.65
128000	0.01	0.20	0.40	0.01	0.50	0.42
256000	0.01	0.11	0.21	0.01	0.13	0.24
512000	0.01	0.06	0.20	0.01	0.06	0.21
0	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01

　　(2)抗體文庫構(gòu)建

　　總 RNA 提取(全血和淋巴細(xì)胞)，RNA提取結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖1.總 RNA凝膠電泳圖.

M: 10kb DNA Ladder, 1: 兔子A總RNA; 2: 兔子B總RNA.

　　反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，可變區(qū)片段擴增并克隆至 M13 噬菌粒，2步法建庫，先連入輕鏈，再連入重鏈，輕鏈( VK和 Vλ )酶切結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖2. VK和 Vλ 輕鏈片段酶切(NheI, NotI)

M: DL2000

1: A兔子VK 片段; 2: A兔子VK 片段(NheI, NotI)

3: A兔子Vλ 片段; 4: A兔子Vλ 片段 (NheI, NotI)

5: B兔子VK 片段; 6: B兔子VK 片段 (NheI, NotI)

7: B兔子Vλ片段; 8: B兔子Vλ片段.

　　原始載體酶切結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖3.pATA-scFv-2 載體酶切結(jié)果(NheI, NotI, KpnI).

M: 1kb DNA Ladder , 1: pATA-scFv-2 , 2: pATA-scFv-2(NheI, NotI, KpnI)

　　將輕鏈載體轉(zhuǎn)化 TG1 ，構(gòu)建噬菌體文庫，對單克隆進(jìn)行菌落 PCR 分析，挑選陽性克進(jìn)行測序，PCR鑒定結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖 4. PCR鑒定48個克隆結(jié)果

M: DL2000, 1-24: pATA-VK; 25-48: pATA-Vλ.

　　將PCR陽性的克隆測序，測序引物為 M13-48，得到的輕鏈文庫庫容如下：

　　pATA -VK 噬菌體抗體庫庫容 =1.44×10^9 cfu,

　　pATA -Vλ 噬菌體抗體庫庫容 =1.43×10^9 cfu。

　　將重鏈酶切后連入輕鏈載體構(gòu)建scFV文庫，輕鏈載體酶切結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖 5. pATA-VK 和pATA-Vλ 酶切結(jié)果(SfiI, XhoI, NcoI).

　　M: 1 kb DNA Ladder

　　1: pATA-VK;2:pATA-VK(SfiI, XhoI) ;3:pATA-Vλ;4: pATA-Vλ(SfiI, XhoI)

　　重鏈片段酶切結(jié)果如下：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖 6. VH酶切 (SfiI, XhoI).

M: DL2000 , 1: VH 片段, 2:VH 片段(SfiI, XhoI)

將重鏈分別連入輕鏈(K和λ)載體后轉(zhuǎn)化TG1進(jìn)行scFV文庫克隆PCR鑒定，結(jié)果如下：

圖 7. pATA-scFv-KH克隆PCR鑒定結(jié)果

M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-KH.

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖 8. pATA-scFv-λH克隆PCR凝膠電泳圖

M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-λH

　　最后構(gòu)建的pATA-scFv-VH庫容如下：

　　pATA-scFv-KH 噬菌體展示文庫庫容 =1.56×10^10 cfu,

　　pATA-scFv-λH 噬菌體展示文庫庫容=1.03×10^10 cfu。

　　3. scFV抗體文庫固相淘選

　　將得到的融合蛋白A-B-C 按照下表條件進(jìn)行淘選：封閉，噬菌體-抗原反應(yīng)，洗脫，測定滴度。

　　表2 每一輪淘選條件

輪數(shù)	包被抗原(μg/mL)	封閉緩沖液	洗滌次數(shù)	洗脫產(chǎn)物(ul)
1	A-B-C (50)	5% milk/PBST	5	800
2	A-B-C (50)	5% milk/PBST	5	700
3	A-B-C (50)	1% Casein/PBST	5	600
4	A-B-C (100)	5% milk/PBST	5	600
5	A-B-C (100)	1% Casein/PBST	6	600

　　重復(fù)5輪，根據(jù)結(jié)果判斷是否有特異性富集：

表3. 淘選結(jié)果

輪數(shù)	蛋白	投入(pfu)	輸出(pfu)
1	A-B-C (50)	1×1012	1.1×107
2	A-B-C (50)	4.4×1011	1.7×108
3	A-B-C (50)	2×1012	3×106
4	A-B-C (100)	8.5×1011	3×106
5	A-B-C (100)	3×1011	1.2×107

　　(3)多克隆ELISA實驗驗證，結(jié)果如下：

表4. 多克隆噬菌體ELISA結(jié)果（Ag:A-B-C；NC: PBS）

噬菌體（pfu/ml）	1輪		2輪		3輪		4輪		5輪
噬菌體（pfu/ml）	抗原	陰性對照	抗原	陰性對照	抗原	陰性對照	抗原	陰性對照	抗原	陰性對照
1×1012	0.34	0.20	0.30	0.22	1.16	0.31	0.88	0.12	4.20	0.18
3.16×1011	0.22	0.28	0.20	0.13	1.55	0.30	1.68	0.12	3.21	0.11
1×1011	0.26	0.20	0.13	0.09	0.89	0.52	2.56	0.07	2.19	0.09
3.16×1010	0.24	0.13	0.09	0.07	0.37	0.32	1.42	0.07	1.56	0.09
1×1010	0.23	0.14	0.07	0.07	0.22	0.52	1.03	0.03	1.02	0.04
3.16×109	0.21	0.13	0.10	0.07	0.15	0.18	0.40	0.03	0.61	0.04
1×109	0.17	0.18	0.11	0.11	0.14	0.31	0.24	0.02	0.35	0.05
blank	0.25	0.17	0.13	0.15	0.18	0.32	0.05	0.04	0.03	0.07

　　根據(jù)以上結(jié)果，我們選取了第3/4/5輪淘選所得噬菌體進(jìn)行了單克隆ELISA檢測：

表5.單克隆ELISA結(jié)果（抗原-R3P1）-抗原: A-B-C ；陰性對照: PBS

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.07	0.06	0.07	0.11	0.07	0.11	0.19	0.23	0.23	0.26	0.28	0.38
B	0.09	0.05	0.09	0.10	0.12	0.12	0.15	0.24	0.19	0.24	0.33	0.39
C	0.07	0.04	0.08	0.08	0.07	0.13	0.21	0.16	0.27	0.25	0.29	0.46
D	0.07	0.06	0.06	0.05	0.11	0.22	0.11	0.16	0.26	0.31	0.34	0.41
E	0.06	0.03	0.05	0.04	0.16	0.11	0.06	0.06	0.21	0.33	0.36	0.33
F	0.07	0.06	0.05	0.09	0.16	0.14	0.16	0.19	0.17	0.27	0.16	0.28
G	0.06	0.07	0.06	0.09	0.11	0.14	0.06	0.19	0.34	0.32	0.45	0.19
H	0.08	0.09	0.08	0.23	0.23	0.27	0.21	0.30	0.21	0.39	0.38	0.21

表6.陰性對照結(jié)果 (NC-R3P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.05	0.05	0.03	0.08	0.07	0.04	0.11	0.12	0.22	0.41	0.49	0.45
B	0.05	0.08	0.04	0.11	0.06	0.06	0.08	0.12	0.15	0.44	0.33	0.44
C	0.05	0.04	0.04	0.07	0.09	0.04	0.09	0.11	0.27	0.23	0.27	0.42
D	0.05	0.04	0.03	0.09	0.05	0.04	0.07	0.12	0.17	0.26	0.26	0.44
E	0.04	0.03	0.03	0.04	0.05	0.06	0.06	0.12	0.24	0.13	0.16	0.34
F	0.06	0.04	0.05	0.08	0.07	0.04	0.08	0.11	0.22	0.12	0.22	0.46
G	0.06	0.06	0.07	0.09	0.07	0.07	0.10	0.16	0.16	0.20	0.26	0.37
H	0.07	0.09	0.06	0.12	0.10	0.09	0.15	0.21	0.19	0.21	0.33	0.36

　　表7.單克隆ELISA(Ag-R4P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.07	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.05	0.04	0.05	0.04
B	0.08	0.03	0.46	0.02	0.02	0.02	2.63	0.09	0.04	0.03	0.09	0.04
C	0.12	0.02	0.03	0.02	0.03	0.02	0.02	0.03	0.05	0.03	0.07	0.03
D	0.09	0.02	0.02	0.03	0.02	0.03	0.03	0.03	0.03	3.17	0.06	0.08
E	0.09	0.03	0.02	0.02	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.03	0.09	0.09
F	0.12	0.04	0.03	0.02	0.04	0.03	1.69	0.05	0.04	0.03	0.04	0.10
G	0.08	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.04	0.05	0.05	0.07	0.09	0.11
H	0.12	0.05	0.03	0.04	0.06	0.07	0.08	0.14	0.10	0.10	0.09	0.18

表 8.單克隆ELISA(NC-R4P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.03	0.03	0.04	0.03	0.04	0.03	0.04	0.04	0.10	0.11	0.14	0.22
B	0.05	0.03	0.03	0.02	0.05	0.03	0.03	0.03	0.06	0.05	0.09	0.22
C	0.06	0.02	0.03	0.03	0.03	0.04	0.03	0.04	0.07	0.05	0.13	0.20
D	0.05	0.03	0.03	0.03	0.04	0.03	0.03	0.03	0.04	0.05	0.12	0.26
E	0.07	0.03	0.05	0.04	0.08	0.05	0.05	0.07	0.09	0.10	0.14	0.28
F	0.06	0.04	0.04	0.05	0.05	0.08	0.05	0.06	0.07	0.12	0.20	0.25
G	0.08	0.03	0.03	0.03	0.06	0.03	0.05	0.06	0.04	0.04	0.05	0.22
H	0.09	0.06	0.05	0.07	0.07	0.09	0.09	0.07	0.10	0.12	0.16	0.27

　　表 9.單克隆ELISA(Ag-R5P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.09	0.06	0.02	0.03	1.03	0.03	0.05	0.04	2.01	0.04	0.10	2.74
B	2.00	2.02	0.02	0.01	0.06	1.47	1.91	0.01	0.02	0.08	1.71	0.09
C	0.03	0.02	0.01	1.46	0.01	1.02	2.27	1.80	1.60	1.59	0.02	0.08
D	1.79	0.02	0.01	0.01	0.01	0.02	0.02	0.02	0.22	0.01	0.01	0.06
E	0.02	1.50	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.01	0.01	1.42	1.42
F	0.02	0.02	1.65	0.99	0.01	0.02	1.51	0.02	0.02	1.95	0.01	0.09
G	0.03	1.83	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.03	0.03	2.05
H	0.14	1.66	0.10	0.67	2.16	0.12	2.24	0.10	0.11	1.89	0.13	0.27

　　表 10.單克隆ELISA(NC-R5P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.03	0.02	0.02	0.02	0.04	0.03	0.03	0.04	0.04	0.06	0.05	0.06
B	0.04	0.03	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.04	0.02	0.10
C	0.03	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.02	0.02	0.01	0.02	0.04	0.14
D	0.03	0.02	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.01	0.03	0.08
E	0.03	0.03	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.07
F	0.03	0.02	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.06
G	0.03	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.03	0.02	0.02	0.03	0.06
H	0.04	0.07	0.06	0.04	0.04	0.05	0.03	0.05	0.06	0.04	0.04	0.17

　　根據(jù)以上結(jié)果，將陽性克隆進(jìn)行測序，得到了 14條不同的序列,針對14個陽性克隆采用A-B-C和A蛋白(甲方提供)又進(jìn)行了二次驗證，結(jié)果如下：

表 11. 二次驗證ELISA結(jié)果

克隆編號	抗原1	抗原2	陰性對照
R5P1-A9	1.8424	0.1964	0.1172
R5P1-A12	2.339	0.1355	0.146
R5P1-B1	2.296	0.1848	0.1593
R5P1-B6	2.1471	0.3191	0.309
R5P1-B11	1.868	0.2985	0.3075
R5P1-C6	2.4653	0.3502	0.22650
R5P1-C7	3.8706	4.0711	0.20770
R5P1-C9	3.9672	4.441	0.14710
R5P1-C10	2.0621	0.1691	0.2446
R5P1-E12	1.956	0.1201	0.2052
R5P1-F10	1.9198	0.2083	0.3152
R5P1-G2	3.4017	3.3381	0.3472
R5P1-G12	2.5475	0.3953	0.4183
R5P1-H4	2.0672	2.7704	0.5009

　　根據(jù)以上結(jié)果，得到了4條針對蛋白A的序列，序列略(保密)。

　　4. 抗體重組表達(dá)

　　將得到的4個抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別和兔重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)(kappa)序列連接后基因合成，分別亞克隆到普健生物自有表達(dá)載體pATX2，共轉(zhuǎn)XtenCHO細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清后進(jìn)行Protein A純化，得到的抗體采用SDS-PAGE進(jìn)行質(zhì)檢，純度結(jié)果如圖所示：

噬菌體展示抗體庫構(gòu)建及淘選

圖9. 重組抗體質(zhì)檢圖. 考馬斯亮藍(lán)

A. 還原PAGE. B. 非還原PAGE.

MW. 蛋白Marker.

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