大腸桿菌是最早用來表達(dá)重組蛋白的第一個宿主,因為其成本低、效率高、遺傳背景清晰等特點(diǎn),使得其在實驗室中使用非常的廣泛。但是,對于很多人來說,想要完美實現(xiàn)大腸桿菌原核蛋白表達(dá)相對來說也是非常困難的。有鑒于此,普健生物在這里和大家具體聊聊有關(guān)原核細(xì)胞表達(dá)的常見問題。
問題一:什么情況下選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最常見的表達(dá)系統(tǒng)之一,優(yōu)點(diǎn)是遺傳背景清晰、成本低、表帶量高等,缺點(diǎn)是容易形成包涵體以及無法進(jìn)行表達(dá)后修飾。所以,這個表達(dá)系統(tǒng)更適合用來進(jìn)行原核表達(dá)不需要后期修飾的蛋白,特別是小分子蛋白;
問題二:如何形成二硫鍵
未改造的大腸桿菌形成二硫鍵的能力相對要差一些,需要有針對性地對二硫鍵形成進(jìn)行改造,提升其表達(dá)能力;
問題三:大腸桿菌的表達(dá)載體有哪些
用于大腸桿菌表達(dá)的載體較多,常用的有pET系列、pGEX系列、pCold系列等;
問題四:如何實現(xiàn)大腸桿菌的分泌表達(dá)
大腸桿菌擁有一套特殊的分泌機(jī)制,通過外分泌信號將蛋白富集到培養(yǎng)基中,但是由于其細(xì)胞壁較厚,使得分泌所得的蛋白量較低;
問題五:為什么會形成包涵體
原核表達(dá)常常會因為蛋白的錯誤折疊或過快表達(dá)而形成包涵體,主要原因是因為:目標(biāo)產(chǎn)物本身性質(zhì)不合、宿主體系不合以及表達(dá)條件不合等原因;
問題六:原核表達(dá)如何實現(xiàn)蛋白純化
原核表達(dá)蛋白純化的方式主要有親和層析、離子交換、凝膠排阻層析等;
問題七:去除信號肽會不會影響蛋白表達(dá)
原核表達(dá)真核蛋白時信號肽是一定要去除的,這個方法在大腸桿菌中可行;
問題八:如何提升蛋白的可溶性
原核大量表達(dá)時,很容易形成包涵體,可以通過選擇促溶標(biāo)簽、篩選合適宿主菌、改變培養(yǎng)誘導(dǎo)條件等方法提升其可溶性;
總的來說,大腸桿菌原核蛋白表達(dá)過程中需要注意的事項還是比較多的,但是相比其他技術(shù)來說,其技術(shù)條件相對成熟,操作也更加方便。當(dāng)然了,對于一些特殊表達(dá),大腸桿菌可能不合適,這個時候就需要挑選一個更加合適的表達(dá)方法了。普健生物專業(yè)為廣大用戶提供大腸桿菌原核表達(dá)服務(wù),如果您有相關(guān)需求,歡迎來電咨詢。